钩吻发酵减毒的谱效关系

黄美霞，王英豪，廖华军，李德森，陈亮，吴水生（.福建中医药大学药学院，福建福州350；.福州市中医院，福建福州35000）

钩吻发酵减毒的谱效关系

黄美霞1，王英豪1，廖华军1，李德森1，陈亮2，吴水生1
（1.福建中医药大学药学院，福建福州350122；2.福州市中医院，福建福州350001）

目的研究钩吻发酵解毒的机理。方法运用双向固体发酵原理与技术，将不同药用真菌接种到灭菌的钩吻药性基质上，在特定条件下进行发酵，得到药性菌质；用HPLC法对发酵前后菌质中的钩吻碱甲、钩吻素子、葫蔓藤碱甲、钩吻绿碱、葫蔓藤碱乙含量进行测定。结果相同发酵条件下，不同真菌对钩吻的发酵情况有所不同，灵芝、云芝、赤芝能够正常生长，其生物碱含量与钩吻生品比较呈下降趋势。结论双向固体发酵后菌丝体生长良好的菌质中，钩吻的液相色谱行为发生了质和量的变化。

钩吻；发酵解毒；谱效关系

钩吻Gelsemium elegans（Gardn.et Champ.）Benth.系马钱科Loganiaceae钩吻属Gelsemium植物，其化学成分主要为生物碱。钩吻与马钱子同属胡蔓藤属，毒性成分与有效成分也是生物碱类，马钱子应用发酵解毒方法获得了一定的成功，理论上推导钩吻也可以通过发酵法来达到减毒目的。我们用双向性固体发酵的理论和方法［1］，用不同的药用真菌，以钩吻根茎作为药用基质，在一定条件下经固体发酵，获得特定的菌质。建立HPLC法，对发酵前后钩吻中不同生物碱含量进行测定，分析其在性质与定量上的变化，为钩吻减毒存效的机理研究提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司）；岛津LC solution工作站、DV215CD型1／10万分析天平（美国利奥豪斯公司）；乙腈（德国Merck公司；Milli-Q型超纯水仪（美国Millipore公司）；余试剂为分析纯。

1.2 对照品钩吻碱甲、钩吻素子、葫蔓藤碱甲、钩吻绿碱、葫蔓藤碱乙（上海市将来实业股份有限公司），纯度经HPLC-UV和HPLC-ELSD（面积归一法）检测含量＞98%。

1.3 供试品用双向固体发酵技术，通过对茯苓、灵芝、猴头真菌的生物转化，发酵后从基质中获得6个钩吻的菌质样品，其中1个为空白对照（未经发酵）样品。

1.3.1 真菌的选择选用茯苓、灵芝、猴头3个药用真菌（四川省岷源高新所菌种生产中心）。

1.3.2 基质来源钩吻（生品）采集于福建省宁德市霞浦县，经福建中医药大学药学院杨成梓副教授鉴定为马钱科葫蔓藤属植物Gelsemium elegans（Gardn.et Champ.）Benth.。

2 方法与结果

2.1 钩吻的双向固体发酵

2.1.1 菌种的扩大培养土豆斜面培养基土豆去皮，切块200 g，加入1 L水中，煮沸30 min，用8层纱布过滤，补充水至1 L，加入蔗糖20 g，加热，加入琼脂1.6 g，搅拌融化。趁热进行分装，液体分装高度以不超过试管高1／5为宜，121℃高压蒸气灭菌20 min。将灭菌的试管培养基放冷至60℃，搁置斜面，培养基以距离试管口1／3长度为宜。将健康菌落接人上述培养基中，28℃下恒温培养7 d.

2.1.2 基质制备将钩吻干燥、粉碎、过40目筛，称钩吻粉末，加无菌水至刚好呈流动态，121℃灭菌20 min，作为基质备用。

2.1.3 菌悬液的制备及药材接种取经过扩大培养的菌种，加入0.9%无菌NaC1溶液，制成菌悬液。吸出孢子悬液至无菌试管内备用。将菌种以菌悬液的形式接种到药性基质中，接种量为1 mL／g菌悬液，混匀，28℃下培养30 d，观察并记录菌种生长情况。同时，将相同接种量的无菌水接种到等量药性基质中，同一条件下发酵，制备空白对照基质。

2.2 对照品的制备取钩吻碱甲、钩吻素子、葫蔓藤碱甲、钩吻绿碱、葫蔓藤碱乙对照品适量，精密称定，加入甲醇制备成分别含108.01、126.01、73.01、300.03、101.02 mg／L的混合对照品储备液备用。

2.3 供试品溶液制备取钩吻、钩吻发酵产物、空白对照基质（过40目筛）1 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入90%乙醇20 mL，85℃水浴回流提取3次，过滤，合并滤液，浓缩至干，用甲醇溶解，转移并定容至10 mL，得供试品溶液。

2.4 色谱条件在预试验及相关文献基础上，确定6种钩吻生物碱的含量测定方法。色谱柱：依利特SinoChrome ODS-BP（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%三乙胺水溶液；梯度洗脱：（0～20 min，乙腈10%～15%；20～40 min，乙腈15%～20%；40～60 min，乙腈20%～30%；60～80 min，乙腈30%～40%；80～85 min，乙腈40%～50%；85～90 min，乙腈50%～80%；90～95 min，乙腈80%～10%；95～100 min，乙腈10%～10%）；体积流量：1 mL／min；柱温：40℃；检测波长：254 nm；进样量20 μL。计算其含量，结果见表1。

表1 发酵前后钩吻生物碱成分含量变化

图1 钩吻对照品色谱图

图2 药材供试品色谱图

3 讨论

3.1 色谱条件的优化通过比较不同厂家不同规格色谱柱对钩吻6种生物碱成分的分离效果，最终选择依利特SinoChrome ODS-BP（4.6 mm×250 mm，5 μm）。在流动相的选择中，比较了甲醇-0.1%甲酸，乙腈-0.1%甲酸，甲醇-0.1%三乙胺等不同流动相体系的分离效果，发现其基线不稳定，分离效果不好，且拖尾严重，最终确定为乙腈-0.1%三乙胺梯度洗脱时，6种待测物在最短时间达到基线分离。

3.2 双向固体发酵对钩吻中6种生物碱的影响

目前已基本阐明了钩吻炮制减毒的机理，即种子经高温加热，葫蔓藤碱甲破坏，含量明显下降，其它生物碱含量变化较小。由HPLC定性、定量分析的结果可知，经过药用真菌发酵后，其生物碱含量发生不同程度的下降，其中胡蔓藤碱甲含量变化最大，在不同真菌发酵的菌质中均未检测到。灵芝、云芝、赤芝对猴头钩吻发酵效果较为明显，茯苓较弱。在对灵芝、云芝、赤芝菌株发酵后的钩吻菌质的急性毒性研究中，发现其毒性有显著下降。另外，对于茯苓发酵的钩吻，虽然菌丝体长势不甚理想，但如在药性基质中加入营养成分使它们能适应生长，也是值得研究的菌株。

3.3 双向固体发酵对钩吻中化合物的影响对原药材和发酵药材HPLC图谱进行比较（见图1），结果生钩吻中的1、2、4、号峰经云芝、赤芝发酵后未检出，生钩吻中的4、5号小峰经灵芝、猴头发酵后均未检出，说明微生物发酵改变了原药材的化学成分组成。而与生钩吻及灭菌后钩吻相比，发酵药材的7号峰为新增加的峰，推测7号峰可能是药材经微生物发酵后新产生的化学成分。因未对该峰进行纯化分离鉴定，此工作有待进一步进行。

3.3 本实验建立了同时测定钩吻中钩吻碱甲、钩吻素子、葫蔓藤碱甲、钩吻绿碱、葫蔓藤碱乙含量的HPLC方法，操作简便快速，结果准确，适用于钩吻药材的质量控制。药理实验证实双向固体发酵后，灵钩菌质保持了较好的镇痛效果，毒性明显降低，说明运用双向固体发酵技术灵芝菌发酵钩吻的研究，达到了减毒增效的作用。

［1］孙静，马琳，吕斯琦，等.中药发酵技术研究进展［J］.药物评价研究，2011，34（1）：49-52.

R285.5

A

1000-338X（2017）01-0035-03

2016-11-30

福州市卫生局资助课题（2013-S-Wt9），福州市科学技术局资助课题（2014-S-140-3），高等学校博士学科点专项科研基金资助课题（20133519110005）

黄美霞（1982—），女，讲师，医学硕士，主要从事中药药效物质基础及作用机制研究

吴水生（1965—），男，教授。E-mail：wsstcm@163.com