栝楼桂枝汤对大鼠脑缺血再灌注损伤后PARP-1表达的影响

谢晴晴，南丽红，陈喆鸣，蔡婷婷，陈红，黄枚（福建中医药大学药学院，福建福州350122）

栝楼桂枝汤对大鼠脑缺血再灌注损伤后PARP-1表达的影响

谢晴晴，南丽红，陈喆鸣，蔡婷婷，陈红，黄枚
（福建中医药大学药学院，福建福州350122）

目的观察栝楼桂枝汤对大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织中多聚（腺苷二磷酸核糖）聚合酶-1（PARP-1）表达的影响，探讨栝楼桂枝汤的神经保护机制。方法用线栓法制备大脑中动脉闭塞大鼠模型，手术当日大鼠清醒后用栝楼桂枝汤干预，每日1次，7天后用Longa评定法评价神经功能损伤程度，TTC染色检测脑梗死体积，HE染色检测缺血侧大脑皮层的病理改变，免疫组化法检测缺血侧大脑皮层PARP-1的表达。结果与模型组比较，栝楼桂枝汤组能明显改善MCAO模型大鼠的神经功能缺损症状，缩小脑梗死体积，减轻大脑皮层病理损伤，减少大脑皮层PAPR-1的表达。结论栝楼桂枝汤能有效降低缺血再灌注后脑组织的PARP-1表达，具有较好的神经保护作用。

栝楼桂枝汤；脑缺血再灌注损伤；多聚聚合酶-1

栝楼桂枝汤（gualou guizhi decoction，GLGZD）由栝楼根（天花粉）、桂枝、白芍、甘草、生姜、大枣组成，具有滋养经脉、柔筋缓急的功效，治疗中风后肢体痉挛疗效较好［1］。课题组前期研究表明，GLGZD可通过多种机制起到神经保护作用，但其作用机制尚未阐明［2-4］。本研究旨在观察GLGZD对MACO模型大鼠大脑皮层组织中多聚聚合酶-1（Poly（ADP-ribose）polymerase-1，PARP-1）蛋白表达的影响，探讨GLGZD对MCAO模型大鼠的神经保护机制。

1 实验材料

1.1 实验动物SPF级SD雄性大鼠115只，体质重260～280 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号：SCXK（浙）2014-0001，饲养于福建中医药大学实验动物中心。

1.2 实验药物栝楼桂枝汤水提物（福建中医药大学药物化学实验室，1.44 g生药／mL）；尼莫地平（山东鲁抗医药集团赛特有限责任公司）。

1.3 实验试剂PARP-1兔多克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；Elivision plus免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒、山羊血清（福州迈新生物技术开发有限公司）；2，3，5氯化三苯基四氮唑（TTC）（美国Sigma公司）；戊巴比妥钠（德国默克公司）。

1.4 实验仪器TS-12D生物组织自动脱水机（湖北省孝感市宏业医用仪器有限公司）；YB-6LF生物组织石蜡包埋机、YT-7FB生物组织摊烤片机（湖北省孝感市亚光医用电子技术有限公司）；HM325石蜡切片机（美国Thermo公司）；DM4000B LED光学显微镜（德国Leica公司）。

2 实验方法

2.1 MCAO动物模型制作115只大鼠适应性喂养1周后，随机分为假手术组15只，造模组100只，参照Longa的方法制作MCAO模型［5］。禁食不禁水12 h，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠（60 mg／kg）麻醉，取仰卧位，去除颈前被毛，常规消毒，沿颈正中线切口，沿右侧胸锁乳突肌和颈前肌群之间分离左侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。将甲聚硅氧烷涂层的鱼线从左颈中动脉插入大脑中动脉的起始端，栓塞2 h后，拔出鱼线再灌注。假手术组大鼠除了不栓塞大脑中动脉，其余行相同的操作。大鼠自然苏醒后，参照Longa评定法，对其进行神经功能损伤程度的评价。0分，无缺陷；1分，不能伸展对侧前肢；2分，对侧前肢屈曲；3分，轻度向对侧转圈；4分，严重转圈；5分，对侧瘫痪。3～4分为造模成功，纳入实验组，评分至少有2人参与。

2.2 分组与给药将造模成功的大鼠根据评分分为模型组20只，3.6 g／kg GLGZD组（低剂量组）20只，7.2 g／kg GLGZD组（中剂量组）20只，14.4 g／kg GLGZD组（高剂量组）20只，6 mg／kg尼莫地平组20只。给药组于大鼠手术当日清醒后，按1 mL／100 g体质重灌服相应的药物，每日1次，连续7 d。假手术组和模型组给予等体积的生理盐水，7 d后取材进行指标检测。

2.3 TTC染色麻醉大鼠，断头取脑，-20℃冰箱冷却20 min取出，用大鼠脑膜具于视交叉及其前后2 mm处，2 mm冠状切片，将切片置于TTC染液中，37℃避光孵育30 min。正常组织染成玫瑰红色，梗死组织呈白色。数码相机拍照，用Image J 1.37测量，分析梗死区体积占对侧脑体积的百分比。

2.4 HE染色麻醉大鼠用生理盐水和4%多聚甲醛按顺序心脏灌注，开颅取脑，大鼠脑膜具中2 mm切片，置4%多聚甲醛中固定过夜，常规石蜡包埋，5 μm切片，苏木素-伊红染色，光学显微镜下观察拍照。

2.5 PARP-1蛋白表达用免疫组化染色二步法进行检测。步骤：5 μm石蜡切片，3%过氧化氢室温孵育10 min以消除内源性过氧化物酶的活性；经0.01 M枸橼酸钠缓冲液（pH为6）微波修复总时间为15 min，室温冷却后，山羊血清封闭20 min，滴加1∶600稀释的兔多克隆PARP-1抗体，4℃孵育过夜；次日滴加辣根酶标记的抗羊多聚体室温孵育20 min，DAB显色3 min，苏木素复染1 s，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。用PBS替代一抗作为阴性对照。细胞核呈棕黄色为PARP-1阳性表达，每张切片随机选取5个高倍视野，用Image-pro plus 6.0软件观察和记录阳性细胞数。

3 实验结果

实验结果，见表1～表3、图1～图2。

表1 GLGZD对大鼠神经功能损伤的影响

表1 GLGZD对大鼠神经功能损伤的影响

注：与假手术组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.05。

组别假手术组模型组低剂量组中剂量组高剂量组尼莫地平组神经功能评分／分0 2.33±0.491）1.75±0.62 1.67±0.652）1.58±0.512）1.50±0.522）大鼠／只14 14 14 14 14 14

表2 GLGZD对大鼠脑梗死体积的影响

表2 GLGZD对大鼠脑梗死体积的影响

注：与假手术组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.05，3）P＜0.01。

大鼠／只组别假手术组模型组低剂量组中剂量组高剂量组尼莫地平组6 6 6 6 6 6脑梗死体积／% 0 30.18±4.991）22.38±2.57 17.32±3.322）13.54±2.843）12.98±1.633）

表3 GLGZD对大鼠缺血侧大脑皮层中PARP-1阳性细胞表达的影响

表3 GLGZD对大鼠缺血侧大脑皮层中PARP-1阳性细胞表达的影响

注：与假手术组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.05，3）P＜0.01。

大鼠／只组别假手术组模型组低剂量组中剂量组高剂量组尼莫地平组阳性细胞数10.97±0.66 143.23±9.191）90.87±11.30 66.50±7.162）55.93±7.283）61.13±5.813）6 6 6 6 6 6

3.2 HE染色由图1可见，假手术组大鼠：大脑皮层神经细胞无明显病理改变，细胞排列整齐，轮廓清晰，着色均匀；细胞膜完整，细胞核、核仁清晰，胞浆丰富；细胞周围间隙无炎性细胞浸润，无水肿。模型组大鼠：大量细胞变形、坏死，细胞排列紊乱，细胞间的间隙增宽，结构略显疏松，形态异常，不规则，胞体缩小，胞质凝集，胞核固缩浓染，有的细胞界限不清，有炎性细胞浸润，间质水肿明显。给药组与MCAO模型组大鼠相比，病理状态明显改善，组织坏死程度和数量明显减轻或减少。

图1 6组大鼠大脑皮层组织病理图（×200）

图2 6组大鼠大脑皮层组织中PARP-1蛋白的表达（×400）

4 讨论

4.1 PARP-1是广泛存在于真核细胞的DNA修复酶，主要存在于细胞核内，少量表达于细胞质中，在感受和调节细胞应激以及损伤修复中发挥关键作用［6］。机体中PARP-1依据DNA损伤程度及其底物尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的水平发挥双重作用。在正常或DNA轻度受损的细胞中，PARP-1可修复受损DNA，神经细胞能耐受缺血而存活。在脑缺血早期，PARP-1过量表达则通过耗竭大量的底物NAD和ATP，从线粒体转运AIF到细胞核内，炎症介质的过量表达，减少促活因子的表达等途径加剧缺血后脑组织损伤［7－8］。

4.2 研究结果显示，GLGZD可明显减轻MCAO模型大鼠的神经功能症状，缩小脑梗死体积，减轻缺血再灌注后大脑皮层的病理损伤，提示GLGZD具有较好的神经保护作用。免疫组化法检测结果显示，GLGZD治疗后缺血侧大脑皮层中PARP-1蛋白的表达量明显少于模型组，提示GLGZD可通过下调大脑皮层中PARP-1蛋白的表达发挥神经保护作用。

［1］陈瑛玲，陈立典，陶静.栝楼桂枝汤治疗中风后肢体痉挛的临床研究［J］.中医临床研究，2013，5（4）：7－9.

［2］CHEN X，LI H，HUANG M，et al.Effect of Gua Lou Gui Zhi decoction on focal cerebral ischemia-reperfusion injury through regulating the expression of excitatory amino acids and their receptors［J］.Mol Med Rep，2014，10（1）：248-254.

［3］HUANG J，TAO J，XUE X，et al.Gua Lou Gui Zhi decoction exerts neuroprotective effects on post-stroke spasticity via the modulation of glutamate levels and AMPA receptor expression［J］.J Mol Med，2013，31（4）：841-848.

［4］ZHANG S，ZHANG Y，LI H，et al.Antioxidant and anti-excitotoxicity effect of Gualou Guizhi decoction on cerebral ischemia／reperfusion injury in rats［J］.Exp Ther Med，2015，9（6）：2121-2126.

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［6］WOODHOUSE B C，DIANOV G L.Poly ADP-ribose polymerase-1：an in ternational molecule of mystery［J］.DNA Repair（Amst），2008，7（7）：1077-1086.

［7］FATOKUN A A，DAWSON V L，DAWSON T M.Parthanatos：mitochondrial-linked mechanisms and therapeutic opportunities［J］. Br J Pharmacol，2014，171（8）：2000-2016.

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R285.5

A

1000-338X（2017）01-0021-03

2016-11-16

福建省自然科学基金资助课题（2017J01837），国家级大学生创新创业训练计划项目（201510393022）

谢晴晴（1990—），女，2014级中药学专业硕士研究生，主要从事中药神经药理学研究。

黄枚（1966—），女，教授。E－mail：hmei0303@qq.com