陕西西安地区汉族孕龄女性MTHFR基因多态性的分布研究

杨文方 王加丽 张彤 金曦 李文静 李丹阳 王翔 党曦虹 张昌宁

亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)是叶酸和同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)代谢的关键酶，主要功能是将5，10-亚甲基四氢叶酸不可逆还原为5-甲基四氢叶酸。5-甲基四氢叶酸作为体内甲基的主要供体，参与体内嘌呤、嘧啶、DNA、RNA和蛋白质的甲基化修饰。MTHFR cDNA上677位碱基C->T变异可促进该酶分解为单体及辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的解离，进而导致MTHFR催化活性下降，致使体内叶酸的活性形式即5-甲基四氢叶酸生成减少，从而影响DNA、RNA和蛋白质等各种重要大分子的甲基化修饰，导致甲基化程度异常，最终影响胚胎发育[1]；另一方面，由于5-甲基四氢叶酸生成减少，导致Hcy转变成甲硫氨酸过程出现障碍，使血浆Hcy水平异常升高，因而是神经管畸形、复发性流产、妊娠期高血压等疾病的重要危险遗传因素[2]。目前MTHFR多态性和叶酸关系是近些年研究热点。国内多个地区已有人群中MTHFR多态性的报道[3]。本研究旨在采用稳定性和准确性均较高的PCR-芯片法分析西安地区MTHFRC677T位点基因多态性的分布情况，同时和中国其他地区进行比较，进而为出生缺陷一级预防策略的制定提供科学依据。

对象与方法

1.对象：依据知情同意原则，随机抽取2013年6月—2016年2月在西安交通大学第一附属医院进行孕前或早孕检查的汉族孕龄健康女性，排除DNA提取不合格者，有效入组对象共1 966例，年龄18～43岁，平均(28.6±3.9)岁。

2.基因测定：DNA的提取抽取患者外周静脉血2 ml于EDTA抗凝管中，即时提取DNA。用人全血DNA提取试剂盒(上海百傲科技股份有限公司)提取DNA后，存放于-20 ℃冰箱用作下一步实验。MTHFR基因型测定采用PCR-芯片杂交显色试剂盒(上海百傲科技股份有限公司)检测MTHFR基因型。

PCR扩增引物序列如下：上游5′-CAAAGGCCACCCCGAAGC-3′和下游5′-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′，反应体系25 μl:1 mmol/L MgCl2、dNTP 200 μmol/L、正反引物各0.5 μmol/L、TaqDNA聚合酶2 U、模板DNA 5 μg。PCR扩增条件如下：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，35个循环，末次延伸5 min。取10 μl PCR反应产物进行杂交显色，然后用芯片识读仪读取患者基因型。

3.统计学处理：采用SPSS 13.0软件。考虑到多重检验可能增加犯一类错误的概率，本研究利用R语言通过FDR法(false discovery rate)校正P值。采用Pearson相关性检验分析不同地域省份经度、纬度和突变等位基因频率的相关性。利用非参数检验Kruskal-Wallis法分析南北方地区的突变型等位基因频率的差异。采用χ2检验比较本研究和北方总体和南方总体等位基因频率的差异。不同区域的聚类分析采用系统聚类法和K-means聚类法进行。P<0.05为有差异有统计学意义。

结果

1.采用PCR-芯片法对MTHFRC677T分型结果及Hardy-Weinberg平衡检验：采用芯片法可清晰地检测出样本MTHFRC677T位点3种基因型。为了保证检测结果的准确性，芯片上前三列是样品DNA质量的质控点，且每种基因型都有平行重复(如第一行4、5和6点代表C基因型)和其交叉重复(如第二行7，8和9位置)，见图1。Hardy-Weinberg平衡检测显示，三种基因型的P均>0.05，提示所选本遗传平衡，具有一定的地区代表性。

图1 MTHFR C677T基因分型结果 A、B、C依次表示基因型CC、CT和TT

2.西安汉族女性MTHFR基因多态性分布及南北方比较：西安地区汉族孕龄女性MTHFRC677T位点突变型T的频率为53.3%。同时选取已经报道的北方6个地区(包括黑龙江、山东、河南、河北、天津、陕西)和已经报道的南方9个地区(包括江苏、湖北、四川、云南、湖南、江西、广西、广东、海南)的MTHFRC677T基因型的分布，由于同一省份不同地域基因型分布很接近，将这些数据合并计算该地区的分布频率，见表1。西安地区突变的T等位基因的频率和之前报道结果类似(53.3%和54.3%)，说明该研究人群的选择具有代表性。北方地区内部(χ2=81.570，P<0.001)和南方地区内部(χ2=363.214，P<0.001)突变型T等位基因频率的分布各自存在明显的异质性，因此，采用非参数检验Kruskal-Wallis法对我国北方和南方地区进行综合分析，发现北方地区的突变型T等位基因频率显著高于南方地区，差异有统计学意义(P<0.001)。本研究中MTHFRC677T位点突变型T的频率为53.3%，与北方6个地区平均突变频率57.7%比较，差异无统计学意义(χ2=0.398，P=0.528)，但是却明显高于南方9个地区的平均突变频率33.7%，差异有统计学意义(χ2=7.344，P=0.007)。

突变型T等位基因与纬度、经度的相关性研究发现，该突变型T等位基因的分布频率与我国各地区的平均经度无相关性(r=0.471，P=0.065)；但是，该突变型T等位基因的分布频率与我国各地区的平均纬度却呈现正相关(r=0.868，P<0.001)。我国北方地区MTHFRC677T突变型T等位基因的频率明显高于南方，并随着地域纬度的增加而显著性升高,见表2。频率最低出现在南方的海南，但最高地区却出现在北方的山东，而不是纬度最高的黑龙江，提示除了纬度因素外，可能还有其他因素影响着该位点的突变频率分布。西安地区与北方的黑龙江、天津的频率分布均无差异，但低于北方的山东、河南、河北这些纬度较高地区，而又均显著高于纬度较低地的南方9个地区。

3.不同区域MTHFRC677T聚类分析：采用系统聚类法分析不同区域MTHFRC677T基因型分布关系，表明本研究结果和天津、陕西、黑龙江关系最为接近。而北方地区可明显聚成一类，南方地区聚为另一类，进一步说明MTHFRC677T基因型频率的分布在我国存在南北区域差异，见图2。

对各地域的基因型构成比数据，同时采用K-means聚类法进行分析。根据系统聚类法结果，将指定分类数目k设置为2，迭代次数设置为100。最终，K-means分析结果与系统聚类法结果一致，提示南方9个地区聚类为1组(T等位基因频率聚类重心为0.337)，北方6个地区和本研究聚类为2组(T等位基因频率聚类重心为0.571)，两组差异有统计学意义(F=67.758，P<0.001)，见表3。

表1 不同地区汉族孕龄女性MTHFR C677T基因型和等位基因频率比较

注：不同地区汉族孕龄女性MTHFRC677T基因型和等位基因频率比较,*P<0.05

表2 突变型T等位基因与纬度、经度的相关性分析

注：突变型T等位基因频率分布与纬度正相关，r=0.868，*P<0.001；与经度无相关性，P=0.065

图2 MTHFR C677T基因型在我国15个地域的系统聚类分析

案例号区域聚类距离北方1本研究200382黑龙江200063山东200604河南200315河北200066天津200267陕西20028南方8江苏100989湖北1006610四川1002311云南1002612湖南1001313江西1002014广东1005215广西1009516海南10097

注：F=67.758，P<0.001

讨论

出生缺陷是我国严重的公共卫生问题和社会问题。西安地区的出生缺陷率在7.9‰～9.3%[12-13]，根据西安市统计学年鉴报道近些年新增新生儿在8.2万左右，这意味着每年大概有648～760名先天性畸形儿出生，其中先天性心脏病、总唇裂和神经管缺陷是最主要的出生缺陷类型。目前遗传因素是出生缺陷的重要影响因素，目前研究比较多的基因是MTHFR，尤其是其mRNA序列上C677T的突变可导致高度保守的丙氨酸变成缬氨酸。突变型的MTHFR酶活性降低，导致叶酸代谢紊乱，进而导致甲基化异常和血浆Hcy水平升高，进而导致出生缺陷如神经管缺陷[14]、先天性心脏病[15]的发病风险显著升高。而且，MTHFRC677T的突变还会显著增加早期妊娠丢失的风险[16]。

研究发现，MTHFR基因多态性分布存在地域特异性[17]。早在2003年就西安地区人群中MTHFR 677T多态性分布的报道[18]，但纳入样本仅有96名，难以反映MTHFR的基因型分布特征。本研究随机抽样并分析1 966名西安汉族健康孕龄女性MTHFRC677T基因多态性的分布特征，纳入人群基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡，说明抽样人群有很好的代表性。在和已报道省份数据比较发现MTHFRC677T的等位基因频率分布和地理纬度有明显的关系，突变基因型T的频率从山东(63.1%)到最低的海南(24.0%)，和纬度呈明显地正相关，这和我国神经管缺陷发病率北高南低的事实是相符的[19]。

由于不同地区人群的遗传背景存在一定差异，因此出生缺陷一级预防策略的制定应该因地制宜、因人而异，改变和完善目前全国统一推行的一级预防干预模式。目前国家卫计委推荐预防出生缺陷的措施是在孕前3个月至孕早期3个月每日补充叶酸0.4 mg。但在补充相同剂量的叶酸2个月后，MTHFRC677T位点TT型孕妇血浆叶酸水平会显著升高，而同型半胱氨酸明显下降，但依然高于CC型孕妇[20]，提示着叶酸补充还应考虑遗传多态性的影响。通过开展MTHFR的分子流行病学研究，了解不同地区人群的遗传特征，进而为完善出生缺陷一级预防措施提供科学依据。

本研究发现，MTHFRC677T的等位基因频率分布和地理纬度有明显的关系，突变基因型T的频率在我国从南向北逐渐增高。考虑到T突变基因型在我国北方人群中分布频率比较密集，超过50%，且该基因型叶酸利用率较低，相同剂量的叶酸补充干预，该基因型需要更长的时间达到预防出生缺陷的体内微环境负荷量。因此，在出生缺陷的叶酸预防剂量上，在我国北方地区提高干预剂量，将有可能获得更理想的一级预防效果。

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