恶性疟原虫组蛋白甲基转移酶SET7催化结构域的表达及活性鉴定

张亮亮，蔡立娅，魏启美，江陆斌，梁韶晖

（1.温州医科大学 基础医学院 寄生虫学教研室，浙江 温州 325035；2.中科院上海巴斯德研究所分子病毒学和免疫学重点实验室，上海 200031）

恶性疟原虫组蛋白甲基转移酶SET7催化结构域的表达及活性鉴定

张亮亮1，蔡立娅1，魏启美1，江陆斌2，梁韶晖1

（1.温州医科大学 基础医学院 寄生虫学教研室，浙江 温州 325035；2.中科院上海巴斯德研究所分子病毒学和免疫学重点实验室，上海 200031）

目的:构建杆状病毒昆虫表达质粒pFast-N-set7cd、pFast-C-set7cd和无细胞麦胚表达载体pEUHis-set7cd，表达恶性疟原虫组蛋白甲基转移酶SET7催化结构域（PfSET7cd），并鉴定PfSET7cd的组蛋白甲基转移酶活性。方法:通过分子克隆技术构建获得pFast-N/C-set7cd以及pEU-His-set7cd表达质粒，尝试通过杆状病毒传代方式与无细胞麦胚表达方式获得重组PfSET7cd蛋白，以SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物，并进一步检测重组蛋白的酶活性。结果:用于昆虫表达的重组质粒pFast-N-set7cd、pFast-C-set7cd双酶切结果大小与测序结果均正确，但是Western blot并未检测到其在昆虫细胞中的可溶性表达产物；pEU-His-set7cd通过无细胞麦胚表达系统表达获得的蛋白与预测大小一致，经Western blot鉴定正确，并用NTA-Ni2+亲和层析纯化。体外酶活实验显示PfSET7cd具有催化H3第36位赖氨酸上三甲基化（H3K36me3）活性。结论:通过无细胞表达系统获得可溶性的PfSET7cd重组蛋白，PfSET7cd重组蛋白具有介导H3K36me3的活性，但不影响H3K4me3和H3K9me3水平。

恶性疟原虫；组蛋白甲基转移酶；重组蛋白表达；无细胞麦胚表达系统；活性鉴定

疟疾为世界上三大传染病之一，严重危害着人类的健康。最新统计显示全球每年约有2亿人感染疟疾，死亡人数达到60万之多[1]，了解疟原虫致病机制显得尤为重要。恶性疟原虫感染过程中，毒力基因家族（var家族、rif家族和stevor家族）与致病密切相关[2-4]。已有研究发现，组蛋白表观遗传学修饰在调控恶性疟原虫毒力基因表达的过程中发挥着非常重要的作用，组蛋白表观遗传学修饰控制着毒力基因家族的激活、沉默以及选择性表达，并和红内期裂殖子侵染以及耐药性产生[5]有关。但直到目前为止对疟原虫组蛋白修饰酶的研究并不多，尤其是参与组蛋白甲基化修饰的组蛋白甲基转移酶（histone methyltransferase，HMTs）。研究HMTs不仅可以从生化水平明确蛋白质的活性功能，同时能深刻理解该类HMTs在恶性疟原虫感染致病过程中所扮演的角色，更为以后进一步预防和治疗疟疾提供理论基础和相应的潜在药物靶点。

CUI等[6]通过生物信息学分析，将恶性疟原虫Pf11_0160基因的产物注释为SET7。在人类细胞中，SET7/9主要控制组蛋白H3K4甲基化，能广泛调节多种类型基因的激活[7]。因此，作为一个潜在的转录激活候选因子，我们尝试研究该恶性疟原虫组蛋白甲基转移酶SET7（Plasmodium falciparum histone-lysine N-methyltransferase SET7，PfSET7）的组蛋白修饰功能，为后续研究其在恶性疟原虫基因尤其是毒力基因和抗药基因表达调控中的作用提供理论基础。

本研究通过序列分析获得PfSET7催化结构域（PfSET7 catalytic domain，PfSET7cd）编码序列，分别使用杆状病毒昆虫细胞表达系统和无细胞麦胚表达系统来表达PfSET7cd，并对表达获得的重组PfSET7cd蛋白的酶学性质和功能进行了初步的分析研究，为进一步了解PfSET7的功能及针对PfSET7进行相关药物的研制奠定了一定的实验基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 载体与菌种:恶性疟原虫Plasmodium falciparum 3D7，pFast-Bac-N/C、pEU-His载体为本实验室保存；感受态大肠杆菌DH5α、感受态DH10Bac购自南京诺唯赞生物有限公司；昆虫细胞Sf9为本实验室保存；引物和基因测序由上海生物工程有限公司完成，Snakeskin透析袋购自美国Pierce公司。

1.1.2 主要试剂:限制性内切酶购自美国Thermo scientific；In-fusion无缝连接试剂盒购自南京诺唯赞生物有限公司；质粒小抽中抽试剂盒、胶回收试剂盒购自德国Qiagen公司；昆虫培养基Sf-900TMII SFM（1×）购自美国Gibco公司；脂质体转染试剂LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；组氨酸标签抗体购自南京EnoGene公司，辣根过氧化酶（HRP）标记的山羊抗鼠二抗购自上海联科生物技术公司。麦胚无细胞蛋白表达试剂盒WEPRO 7240H购自北京天根生化有限公司；组蛋白甲基化H3K4me3抗体、H3K9me3抗体和H3K36me3抗体购自美国Abcam公司；牛胸腺组蛋白提取物购自美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 pFast-N/C-set7cd和pEU-his-set7cd质粒的构建:恶性疟原虫P.falciparum 3D7按照文献[8]方法进行培养并提取基因组。引物序列见表1。PCR扩增PfSET7基因PF11_0160中的SET结构域片段（260 aa-654 aa），基因序列大小为1 185 bp，PCR反应条件为:94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s；54 ℃ 30 s；60 ℃ 60 s；60 ℃ 7 min；30个循环。利用Infusion无缝连接方式将目的序列插入到对应的载体中，线性化载体时pFast-Bac-N限制性酶切位点为Sal I/Hind I I I、pFast-Bac-C限制性酶切位点为EcoR I/Xho I、pEU-His载体限制性酶切位点为Xho I/Not I。pFast-N-set7cd与pFast-C-set7cd质粒的SUMO-His标签分别位于pFast-Bac载体多克隆位点目的序列的N端和C端，可与插入片段融合表达。

1.2.2 昆虫细胞表达系统表达:将测序正确的质粒pFast-N/C-set7cd分别转化至感受态DH10Bac中，通过蓝白斑筛选48 h后挑取阳性单克隆菌37 ℃培养24 h后提取杆状病毒基因组，通用引物M13F/R进行PCR鉴定。PCR鉴定反应条件为:94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s；55 ℃ 1.5 min；72 ℃ 6 min；30个循环。用脂质体方式将鉴定正确的杆状病毒基因组转染到昆虫细胞Sf9中。转染用的昆虫Sf9细胞密度控制在1×106～2×106之间，具体的转染、培养与蛋白表达步骤参照美国Invitrogen公司Bac-to-Bac TOPO Expression system操作手册，病毒传代第三代时（12 d）检测蛋白。

1.2.3 无细胞麦胚系统表达PfSET7cd:将测序正确的质粒pEU-His-set7cd转化培养提取质粒进行体外转录后翻译。转录条件为PCR仪中37 ℃孵育6 h。转录的mRNA在6孔板中进行翻译，15 ℃，孵育20 h。其中小量反应和大量反应所用质粒量为1 μg和4 μg，反应体系和具体步骤参照试剂盒WERPR 7240H使用说明。

表1 PCR引物序列信息

1.2.4 重组蛋白检测:转染后的昆虫细胞Sf9进行病毒传代培养表达目的蛋白，将12 d时收集的样品分为培养基、细胞超声裂解后的上清、沉淀；无细胞麦胚表达系统表达产物经离心分为上清和沉淀。2种表达体系得到的各样品分别进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）和考马斯亮蓝染色，分析目的蛋白的表达。另将得到的各样品进行Western blot鉴定，一抗为鼠源性抗His单抗（1∶2 000稀释），二抗为山羊抗鼠抗体（1∶5 000稀释）。

1.2.5 PfSET7cd蛋白浓缩与纯化:麦胚无细胞表达的产物经8 000 r/min、4 ℃离心15 min后收集上清，将收集的上清置于透析袋4℃透析过夜（透析缓冲液:500 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.9）。透析后上清使用NTA-Ni2+亲和层析法进行纯化[9]并用10% SDS-PAGE鉴定，鉴定后的PfSET7cd蛋白用含有20%甘油的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.4）4 ℃过夜透析，浓缩后-20 ℃保存。

1.2.6 PfSET7cd体外酶活鉴定:取纯化后PfSET7cd蛋白1 μg与底物组蛋白2 μg在缓冲液中（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，10%甘油，20 mmol/L KCl，5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L DTT，1 mmol/L PMSF，S-腺苷甲硫氨酸）充分混匀，30 ℃孵育4 h，阴性对照用反应缓冲代替PfSET7cd蛋白。此外，我们用人源的H3K9me2的甲基转移酶G9a作为检测体系的阳性对照，其使用量及反应条件与PfSET7cd一致。反应结束后用15% SDS-PAGE胶进行Western blot鉴定组蛋白底物中H3K4me3、H3K9me3和H3K36me3的变化，一抗为Abcam公司对应的甲基化抗体（1∶2 000稀释），二抗为山羊抗兔抗体（1∶10 000稀释）。

2 结果

2.1 pFast-N/C-set7cd、pEU-His-set7cd质粒的构建以及重组病毒基因组的鉴定 构建的质粒pFast-N-set7cd和pFast-C-set7cd分别用Sal I/Hind I I I、EcoR I/Xho I双酶切和测序鉴定构建成功（见图1A）。将成功构建的pFast-N/C-set7cd质粒转化至大肠杆菌DH10Bac中，挑取单克隆菌经培养提取重组杆状病毒基因组，PCR鉴定大小为3 625 bp（见图1B）。对构建好的质粒pEU-His-set7cd进行PCR鉴定，结果为1 185 bp，与目的序列大小一致（见图1C），测序结果正确。

图1 PfSET7cd重组质粒构建

2.2 重组蛋白表达纯化与鉴定 SDS-PAGE考马斯亮蓝染色和Western blot鉴定显示set7cd在昆虫表达系统并没有获得可溶性蛋白，目的蛋白仅出现在细胞裂解后的沉淀中，即蛋白以包涵体的形式表达，并且表达量低，考马斯亮蓝染色无法检测。而无细胞麦胚表达系统得到了预期的目的蛋白，SDS-PAGE考马斯亮蓝染色显示，实验组在50 kDa处有一条明显的条带（见图2A），与预测大小一致；Westernblot结果显示，同一位置的条带具有组氨酸标签（见图2B），经过NTA-Ni2+亲和层析纯化得到PfSET7cd（见图2C），因此我们通过无细胞麦胚表达方式成功获得融合了组氨酸标签的可溶性PfSET7cd。

图2 PfSET7cd蛋白表达与鉴定

2.3 PfSET7cd蛋白体外酶活鉴定 根据甲基化修饰的赖氨酸位点不同，可以激活基因的转录亦可以抑制基因转录。我们选取并检测了恶性疟原虫组蛋白H3常见的3个甲基化修饰位点（H3K4、H3K9和H3K36）的三甲基化变化。用对应的抗体进行Western blot检测，结果显示PfSET7cd并没有改变H3K4和H3K9的三甲基化水平，但是H3K36三甲基化水平明显升高，这表明PfSET7cd蛋白具有催化H3K36三甲基化形成的能力，见图3。

图3 PfSET7cd蛋白体外酶活鉴定

3 讨论

目前，疟疾在许多国家依然是一个重大的公共卫生负担，伴随着疟原虫抗药性的发生和扩散日趋严峻[10-11]，人类需要更深刻了解疟原虫的致病和抗药性产生机制来研制针对性的疫苗或药物，而对疟原虫基因功能的注释是最基础的工作[12]。体外对蛋白功能活性进行研究可以避免疟原虫复杂内环境的干扰，有助于获得清晰明确的结论，利用成熟的蛋白表达系统获得具有活性的可溶性蛋白则是重要前提。不同于常见的模式物种，恶性疟原虫来源的蛋白在异源表达时普遍存在表达量低以及表达产物不溶的特点[13]。一方面是该物种的基因组成中AT含量高达80%[14-15]，密码子偏好AT，如AGA/AGG（R），AUA（I），GGA（G）[16]。文献[16]报道，优化E.coli的tRNA组成可以显著提高恶性疟原虫DHPS基因的表达。常见的几种表达系统（大肠杆菌、酵母以及哺乳动物）都没有专门针对高AT编码基因进行过优化，因此容易导致低水平表达的现象发生。另一方面Plasmodium falciparum中的蛋白存在大量单氨基酸及多氨基酸的重复序列，因此在翻译过程中，需要一些特定的辅助因子帮助折叠才能形成正确的构象[17]，而异源表达的过程中缺乏相关辅助因子，所以极易导致蛋白聚集形成不溶沉淀[18]。

昆虫表达系统具有大多数高等真核生物相似的翻译后修饰加工能力，是一类应用广泛的真核表达系统。我们尝试在蛋白的N端或C端融合了SUMO标签以促进产物可溶性，但只有极少量不溶性产物存在于细胞沉淀中。我们怀疑不溶产物是因为缺少必要的折叠辅助因子导致蛋白大量聚集。

本研究中，我们进一步尝试了无细胞麦胚表达系统。该系统具有快速、高通量的优点，并且不需要密码子优化[19-21]。RUI等[22]专门比较过原核表达系统和麦胚无细胞表达系统在恶性疟原虫蛋白表达上的特点，发现麦胚无细胞表达系统更容易获得大量的可溶性蛋白产物。本研究分别用无细胞麦胚表达系统和昆虫细胞表达系统来表达重组PfSET7cd，发现无细胞麦胚表达系统的重组PfSET7cd表达量明显提高，并且都以可溶形式存在，明显优于昆虫细胞表达系统。

CUI等[6]将Plasmodium falciparum的PfSET7归类到SET7家族。已有报道显示人的SET7/9（Hs-SET7/9）主要负责H3K4的甲基化[23]。由于PfSET7和HsSET7/9同源性仅为12.8%，故二者在底物特异性上可能会有所差别。因此在活性检测时，我们同时检测了组蛋白H3的K4、K9和K36位的甲基化修饰。而本研究的结果也显示，PfSET7cd并不能催化H3K4和H3K9的甲基化，而对H3K36三甲基化具有较高活性。

当前已知的在哺乳动物中可催化H3K36发生甲基化的酶有SET2和NSD1[23]，而H3K36甲基化修饰多存在于转录活化基因的编码区，主要影响基因转录的激活过程[24]，与染色体激活区域有关。而在恶性疟原虫中，H3K36甲基化与毒力基因家族的激活有着密切的联系[5]，提示PfSET7有可能参与到毒力基因家族的表达调控中。这为进一步研究PfSET7的生物学功能，探索恶性疟原虫表观遗传及针对PfSET7相关药物抑制剂的研制奠定了一定的基础。

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（本文编辑：赵翠翠）

Expression and activity identif cation of Plasmodium falciparum histone H3 methyltransferase SET7 cata-

lytic domain

ZHANG Liangliang1, CAI Liya1, WEI Qimei1, JIANG Lubin2, LIANG Shaohui1. 1.Department

of Parasitology, School of Basic Medical Science, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 2.Key Laboratory of Molecular Virology & Immunology, Institute Pasteur of Shanghai Chinese Academy of Sciences, Shanghai, 200031

Objective：To construct the recombinant baculovirus expression plasmid pFast-N-set7cd, pFast-C-set7cd and cell-free wheat germ expression vector pEU-His-set7cd, to express Plasmodium falciparum histonelysine N-methyltransferase SET7 catalytic domain (PfSET7cd), and to identify PfSET7cd protein methyltransferase activity.Methods：pFast-N/C-set7cd and pEU-His-set7cd were constructed for expression of recombinant PfSET7cd by baculovirus-insect cell system and wheat germ cell-free expression system, respectively, and recombinant protein was identif ed by SDS-PAGE and Western blotting. Furthermore, recombinant protein was purif ed and applied in vitro enzymatic activity assay.Results：The recombinant plasmid pFast-N-set7cd and pFast-C-set7cd were constructed successfully and conformed by sequencing. However, no soluble PfSET7cd protein was detected by Western blotting in insect cells. By wheat germ cell-free expression system, soluble recombinant PfSET7cd was expressed and the molecular weight of protein agreed well with the theoretical prediction, which was identif ed by Western blot. And then, recombinant PfSET7cd was purif ed with NTA-Ni2+aff nity column. In vitro enzymatic activity assay showed that PfSET7cd exhibites H3K36me3 activity.Conclusion：Soluble recombinant protein, PfSET7cd, can be successfully obtained by wheat germ cell-free expression system, and this protein can catalyze H3K36 trimethylation (H3K36me3) in vitro while has no effects on the H3K4 trimethylation (H3K4me3) or H3K9 trimethylation (H3K9me3).

Plasmodium falciparum; histone-lysine N-methyltransferase; recombinant protein expression; wheat germ cell-free expression system; activity identif cation

R382.3

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.02.006

2016-07-01

浙江省科技厅公益技术研究社会发展项目（2015C33101）；浙江省大学生科技创新活动计划（2014R 413079）；温州市公益科技项目（Y20140481）。

张亮亮（1989-），男，山西长治人，硕士生。

梁韶晖，教授，硕士生导师，Email:lsh@wmu.edu.cn。