二肽酶IV在胃癌中的表达及临床意义

田杰，张志安，孙国兴，肖保增，张文超，杨继涛，张庆永，尹晓，耿国旺

（清河县人民医院 普外科，河北 邢台 054899）

二肽酶IV在胃癌中的表达及临床意义

田杰，张志安，孙国兴，肖保增，张文超，杨继涛，张庆永，尹晓，耿国旺

（清河县人民医院 普外科，河北 邢台 054899）

目的:检测二肽酶IV（DPP IV）在胃癌组织中的表达，探讨其在胃癌预后中的价值。方法:收集本院手术后的胃癌组织及对应癌旁正常组织112例，用免疫组织化学方法定性比较胃癌组织及癌旁正常胃黏膜组织中DPP IV的表达；Western blot定量比较胃癌组织及癌旁正常组织中DPP IV蛋白的表达。结果:免疫组织化学结果示DPP IV在癌旁正常组织中有3例（占2.7%）表达缺失；胃癌组织中有78例（占69.6%）表达缺失；Western blot结果示DPP IV在胃癌组织中的含量明显低于癌旁正常组织；多因素分析示DPP IV是胃癌不良预后的独立预测因子（P＜0.001）。结论:DPP IV表达缺失是胃癌不良预后的独立预测因子。

二肽酶IV；胃肿癌；病理学；预后

1 资料和方法

1.1 一般资料 收集2003年1月至2014年12月在我院普外科行手术治疗的胃腺癌组织及相应的癌旁正常组织112例，术前未经过放疗及化疗。纳入标准∶入选病例均为原发性胃管状腺癌根治标本。排除标准:胃鳞状细胞癌、神经内分泌癌及腺癌活检标本。记录肿瘤部位、大小、组织学分级、浸润深度及淋巴结和远处器官转移情况。所有胃腺癌标本均有完整的病理资料及随访资料，随访时间为手术日至死亡或末次随访日，所有死亡均与癌症复发和转移相关。DDP IV单克隆抗体购自丹麦DaKo生物试剂公司，相应二抗EnVision试剂盒购自北京博奥生物技术公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色:所有供体组织蜡块行常规病理切片后HE染色，经有经验的病理医师采取双盲法对112例胃腺癌组织切片进行复诊及组织学分级确认。冰冻切片机5 μm厚连续切片制成冰冻切片。免疫组织化学染色操作严格按照试剂盒说明书进行，用正常大肠组织切片作阳性对照，PBS替代一抗作阴性对照，切片常规脱蜡，枸橼酸盐加热抗原修复，然后采用EnVision两步法进行免疫组织化学染色。结果判定:DDP IV染色以细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性，采用半定量积分法判断结果。根据染色强度评分:无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；根据阳性细胞数所占百分比评分:＜10%为0分，11%～50%为1分，51%～75%为2分，＞76%为3分。两项得分相乘，0～3分记为（-），4～5分记为（+），6～8分记为（++），≥9分记为（+++）。染色结果为阴性者，认为DDP IV表达缺失。

1.2.2 蛋白质提取及Western blot分析:经液氮超低温保存的112例胃癌及癌旁正常组织用于提取蛋白质以进行Western blot分析。用放射免疫沉淀裂解液提取胃癌组织块中的总蛋白，测定蛋白质浓度以判断标本是否合格，取100 μg样品上清液，聚丙烯酰胺凝胶电泳。4 ℃、100 mA稳流转膜过夜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h。加入DDP IV及β-actin（1∶400稀释）一抗，4 ℃孵育过夜，洗膜后加适量辣根过氧化物酶标记的IgG二抗，于37 ℃孵育2 h，然后在暗室中显影，底片经扫描仪透扫后用凝胶分析软件Image Pro Plus对电泳结果进行灰阶分析，以DDP IV与β-actin 的光密度比值表示其相对表达量。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS16.0统计学软件进行统计学分析，以χ2检验DDP IV的表达与胃癌临床病理参数之间的相互关系；DDP IV在胃癌预后中的价值使用多因素Cox分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DPP4在胃癌中表达的免疫组织化学分析 DDP IV在癌旁组织中有3例（占2.7%）表达缺失，在胃癌组织中有78例（占69.6%）表达缺失（见图1）。DDP IV蛋白表达与胃癌临床病理参数之间的关系见表1，DDP IV的表达缺失与淋巴结转移、肺转移、浸润深度及TNM临床分期相关（P＜0.05）。伴有淋巴结及肺转移者DDP IV的表达缺失的频率增高，胃癌浸润更深及TNM分期更晚者DDP IV的表达缺失的概率更大。

图1 免疫组织化学结果示DDP IV的表达

表1 DPP IV表达与胃癌临床病理参数之间的关系（例）

2.2 DDP IV在胃癌中表达的Western blot分析

Western blot结果显示，癌旁正常组织中DDP IV的表达都明显高于胃癌组织（P＜0.05），而且伴有转移的胃癌组织中DDP IV的表达明显低于无转移的胃癌组织（P＜0.05），见图2。

图2 DDP IV的Western blot结果图

2.3 DPP IV与胃癌临床预后 根据随访结果，对DDP IV蛋白表达阳性组和表达缺失组的生存率进行了Kaplan Meier分析，结果见图3。DDP IV阳性组患者的癌症特异性生存率及癌症无进展生存率明显高于DDP IV表达缺失组，差异有统计学意义（P＜0.01）。经过多因素分析，结果显示DDP IV表达缺失为胃癌患者不良预后的独立危险因子，见表2。

图3 DDP IV表达对生存率的Kaplan Meier分析

表2 胃癌预后因素的多因素Cox回归分析

3 讨论

DPP IV是20世纪60年代末在大鼠肾脏中被发现的，属于丝氨酸蛋白酶家族成员[9]。DPP IV基因位于2号染色体，包括26个外显子，表达于多种细胞表面，如淋巴细胞、黑色素细胞、肠上皮细胞等。DPP IV一般以同源二聚体形式存在，其单体含有766个氨基酸残基，相对分子量11 kD，其细胞外区域具有蛋白酶活性，该酶能从丝裂因子或神经肽的N端切除二肽，从而使之失去活性。最初发现DPP IV是一种淋巴细胞分化分子[10]，在微生物感染等过程中具有免疫调节作用[11-12]；后来DPP IV被发现在多种肿瘤组织存在不同水平的表达降低[13-15]，并有进一步研究[16-19]发现其在肿瘤中起着抑制细胞增殖的作用；还有研究[20]报道DPP IV在鼻咽癌中也存在表达降低，并发挥着抑癌基因的作用。但也有研究发现DPP IV在肺癌[21]中表达升高，张梦真等[22]通过Western blot和RT-PCR实验发现DPP IV在卵巢癌组织中表达明显升高，并且与临床分期、组织学分期与淋巴结转移相关，从而推断DPP IV参与了肿瘤的生长、浸润和转移。SANCHEZ-OTERO等[23]对肺癌等数种肺疾病组织在蛋白质和mRNA水平上对DPP IV进行了研究后发现其起着抑癌基因的作用，而且其发挥作用与p21密切相关。

本研究主要采用了免疫组织化学等常用的生物学实验方法，结果发现DPP IV基本全部表达于正常的胃黏膜，而在胃癌组织中则不同程度地表达降低或缺失；而且随着肿瘤恶性程度的增高，DPP IV的表达缺失更加明显。进而通过Western blot方法分析发现:与正常胃黏膜组织相比，DPP IV在胃癌组织中的表达明显降低，在伴有转移的癌组织中其表达降低程度更大。DPP IV的表达缺失与胃癌浸润深度及有无淋巴结及远处脏器转移有关，而与其病理学类型、组织学分化程度和年龄无关，这些数据提示DPP IV在胃癌的侵袭、转移等过程中发挥了抑制作用。但是关于DPP IV在胃癌中的确切机制，目前研究较少，或是通过调控钾通道的功能而影响肿瘤细胞的生长或存活而实现的，前者在细胞增殖、细胞周期的前进及凋亡中发挥着重要的作用。

本研究应用Kaplan Meier相关分析对实验数据进行分析后发现，DPP IV的表达缺失与患者的癌症特异性生存期及癌症无进展生存期明显相关；进而采用多因素Cox回归分析后显示DPP IV表达缺失是胃癌预后的独立预测因子，通过检测胃癌组织中DPP IV的表达水平可以预测患者以后的病情发展趋势。因本研究为回顾性分析，且收集到的病例数较少，对DPP IV在胃癌中的作用缺少分子生物学水平上的研究、分析。但本研究初步发现了DPP IV在胃癌中发挥着抑癌基因的作用，DPP IV表达缺失是胃癌预后的独立预测因子，而从基因水平上探讨其作用机制应成为接下来研究的重点。

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（本文编辑：赵翠翠）

Expression of dipeptidyl peptidase IV gene in gastric carcinoma and its’ signifance for prognosis

TIAN

Jie, ZHANG Zhi’an, SUN Guoxing, XIAO Baozeng, ZHANG Wenchao, YANG Jitao, ZHANG Qingyong, YIN Xiao, GENG Guowang. Department of General Surgery, the People’s Hospital of Qinghe, Xingtai, 054899

Objective：To evaluate the expression of dipeptidyl peptidase IV (DPP IV) in gastric carcinoma tissue and matched para-tumor tissues, then its clinical pathologic signif cance for gastric carcinoma was investigated.Methods：One hundred and twelve cases gastric carcinomas tissues and the same number of matched para-tumor tissues were selected, expressive difference of DPP IV gene between carcinoma tissues and their matched para-tumor tissues was measured by immunohistiochemistry; with protein concentration level of DPP IV measured by Western blotting methods.Results：The expressive loss number for DPP IV was 3 (2.7%) in 110 normal gastric tissues, while lossed in 78 gastric carcinomas; and the level of DPP IV decreased obviously in DPP IV positive tissues; DPP IV is an independent prognostic factor of gastric carcinoma by multiple factor analysis.Conclusion：Loss of DPP IV’s expression is an independent poor prognostic factor of gastric carcinoma.

dipeptidyl peptidase IV; stomach neoplasm; pathology; prognosis胃癌是人类常见的恶性肿瘤之一，在东方国家发病率及病死率均居恶性肿瘤前列[1-3]；多数胃癌患者病情进展较快，预后不佳。有多项研究显示二肽酶（dipeptidyl peptidase，DDP）家族参与了多种疾病的发生发展过程[4-8]，但是关于DDP IV在胃癌临床病理学中的预后价值鲜有报道，本研究初步探讨了DDP IV在胃癌预后中的价值。

R733.3

B

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.02.013

2016-03-05

田杰（1977-），男，河北清河人，主治医师。