不同发育阶段延边黄牛阉牛背最长肌差异表达基因的筛选

田万年，李香子，夏广军，金 鑫，严昌国*

（1．吉林农业科技学院动物科技学院，吉林吉林 132101；2． 预防兽医学吉林省重点实验室，吉林吉林 132101；3． 延边大学农学院，吉林延吉 133002）

不同发育阶段延边黄牛阉牛背最长肌差异表达基因的筛选

田万年1,2，李香子3，夏广军3，金 鑫3，严昌国3*

（1．吉林农业科技学院动物科技学院，吉林吉林 132101；2． 预防兽医学吉林省重点实验室，吉林吉林 132101；3． 延边大学农学院，吉林延吉 133002）

应用引物退火控制技术（ACP）筛选8月龄和30月龄延边黄牛阉牛背最长肌差异表达基因，寻找与延边黄牛生长发育相关的候选基因。相同饲养条件下，分别检测3头8月龄和30月龄延边黄牛阉牛背最长肌组织的mRNA表达水平变化。利用20对随机引物差异显示扩增，共获得9条ESTs。对Telethonin、MYH7、MSTN、Camk2d和SPP1基因进行荧光定量PCR检测。结果表明：MYH7、 MSTN和SPP1基因在8月龄阉牛组背最长肌中的表达量显著高于30月龄（P＜0．05）；Telethonin和Camk2d在30月龄阉牛背最长肌中的表达量显著高于8月龄（P＜0．05）。结果提示，这些基因可能是影响延边黄牛生长及肉质性状的重要调控基因。

延边黄牛；引物退火控制技术；差异表达基因；荧光定量PCR

骨骼肌的发育调控是一个复杂基因调控，涉及到大量基因的表达及网络调控，鉴定这些基因表达对阐明牛肌肉生长和肉质性状的分子机制以及提高牛肉质量具有重要意义[1]。研究结果表明，动物生长发育的不同阶段存在不同的基因表达机制，一些影响动物生长、肉质性状的候选基因具有表达的时序性。贺花[2]对秦川牛胚胎期（135 d）和成年期（30月龄）背最长肌差异基因进行了筛选，获得了秦川牛背最长肌发育过程中肉质、生长性状差异表达基因。秦立红[3]对草原红牛初生公牛与成年公牛背最长肌组织差异表达基因进行了筛选，获得了肉质性状、生长发育性状以及抗病性状差异基因。唐荣莉等[4]对16月龄和5岁龄蒙古牛臀肌组织差异表达基因进行了分析。恒聪聪等[5]报道，胎儿时期MyoD基因在肌肉中表达量较低，随时间推移表达量逐渐增加，30月龄表达量达到最高。张小辉等[6]报道，18、24月龄IGF基因家族在南阳牛肌肉组织中的表达量与3月龄相比显著降低。目前，有关延边黄牛不同生长阶段背最长肌差异表达基因研究，国内尚未见报道。

延边黄牛是我国五大良种黄牛之一。2008年，延边黄牛（肉用）品种被评为东北第一个肉牛品种。延边黄牛具有抗寒性能好、耐粗饲、抗病性强、容易育肥等特点。牛肉细嫩多汁，鲜美可口，深受消费者青睐。由于长期向役用方向选育，延边黄牛与国外优良肉牛品种相比，存在前躯发育较好但后躯发育偏弱、产肉性能较低等特点。目前，延边黄牛分子遗传资源研究主要从候选基因角度分析与生长、肉质相关的分子遗传标记[7-10]。利用分子生物学技术筛选影响生长、肉质性状的功能基因可以提高寻找候选基因的工作效率，对促进延边黄牛选育改良具有重要意义。本试验采用引物退火控制技术（Annealing Control Primer, ACP），对8月龄和30月龄延边黄牛阉牛背最长肌差异表达基因进行筛选，了解二者背最长肌基因差异表达概况，获得影响生长、肉质性状候选基因，为延边黄牛肉用改良提供理论基础。

1 材料与方法

1．1 实验材料 选择6头遗传背景相同、健康且同一月龄、体重相近的延边黄牛公犊牛，在相同环境条件下饲养，4月龄进行去势，分别在8月龄和30月龄各屠宰3头阉牛，屠宰后采集背最长肌，取样后分装到一次性手套中，纱布包紧后立即放入液氮冻存，运输至实验室后-80℃保存备用。

1．2 方法

1．2．1 总RNA提取及cDNA合成 采用Trizol法分别提取6头牛背最长肌总RNA，溶于20 μL不含RNase的DEPC处理水中。分别取3 μL RNA进行琼脂糖凝胶电泳，检测RNA的完整性，并用紫外分光光度计检测其纯度。对提取到的8月龄和30月龄阉牛总RNA（0．25 μg/μL）各取10 μL组成总RNA池30 μL，冰浴5 min。以Oligo（dT15）ACP为3′端引物逆转录合成cDNA第1链。总反应体系为20 μL：总RNA 2 μg、10×Buffer 4 μL、dNTP（2．5 mmol/L）、dT-ACP1 2 μL、RNase Inhibitor 0．5 μL、SuperscriptⅡ反转录酶1 μL。置42℃ 60 min、94℃ 5 min、冰浴5 min终止反应。逆转录产物用灭菌去离子水5倍稀释，-20℃保存备用。1．2．2 背最长肌差异表达基因的筛选 应用GeneFishingTMDEG kit试剂盒（Seegene公司）20对随机引物ACP同dT-ACP2组合分别对8月龄和30月龄阉牛cDNA进行PCR扩增。PCR反应体系为50 μL：dT-ACP2（1 μmol/L）2．5 μL、随机引物（1 μmol/L）5 μL、dNTP（200 μmol/ L）4 μL、Taq（2．5 U）0．5 μL、10×PCR Buffer 5 μL、cDNA模板5 μL、去离子水28 μL。PCR扩增反应程序：94℃变性5 min，50℃退火3 min，72℃延伸1 min，1个循环；94℃变性40 s，65℃退火40 s，72℃延伸1 min，40个循环，72℃延伸5 min，4℃保存。PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，凝胶分析系统扫描记录，检测扩增结果。

1．2．3 差异基因克隆与序列分析 根据电泳检测结果，紫外灯下切割差异条带，回收纯化差异片段，进行连接和转化，选取阳性克隆质粒送往上海英俊生物有限公司测序。测序结果去除载体序列后在NCBI进行同源性比对。

1．2．4 实时定量PCR分析 以牛β-actin为内参，应用Primer Premier 5．0软件对获得的差异基因序列设计引物（表1）。提取8月龄和30月龄阉牛总RNA后，采用Prime ScriptTMRT-PCR 试剂盒（TaKaRa 公司）制备cDNA，然后用SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒（TaKaRa 公司）进行实时定量PCR，每个样品重复测定3次。计算各个样品目的基因的Ct值和各自内参β-actin的Ct值，基因表达水平以相对表达量的平均值±标准偏差来表示，并用SPSS13．0统计软件对样本进行单因素方差分析。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

2 结果与分析

2．1 延边黄牛阉牛背最长肌差异表达基因 通过20对ACP引物PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳共获得9条8月龄和30月龄阉牛个体背最长肌差异表达ESTs，结果见图1。

2．2 差异片段的同源性比较分析 将差异片段回收后进行测序，将测序获得的各个序列在NCBI网站上进行比对，共获得9条牛的cDNA序列，与8月龄阉牛相比，有6个基因在30月龄阉牛背最长肌中表达水平下调，3个基因表达水平上调，见表2。

2．3 实时定量PCR检测部分差异基因 以牛β-actin基因为对照，采用实时定量PCR检测，结果见图2。MYH7、MSTN和SPP1基因在8月龄延边黄牛阉牛背最长肌中的mRNA表达丰度显著高于30月龄个体（P＜0．05）。Telethonin和Camk2d基因在30月龄延边黄牛阉牛背最长肌中的mRNA表达丰度显著高于8月龄个体（P＜0．05）。

图1 差异表达基因片段筛选电泳图结果

图2 部分差异基因的实时定量PCR检测结果

表2 延边黄牛阉牛背最长肌部分差异表达基因

3 讨 论

ACP技术是Hwang等[11]建立的一种鉴定差异表达基因的方法，已在动物发育和植物相关差异表达基因的克隆中得到广泛应用。吴奎等[12]利用ACP技术对尼罗罗非鱼雌雄鱼肌肉组织差异表达基因进行了筛选，共获得8条ESTs。贾锡伟等[13]利用ACP技术对日本囊对虾性腺差异表达基因进行了筛选。本实验通过ACP技术对2个发育阶段（8月龄和30月龄）延边黄牛阉牛肌肉组织中共筛选获得9条表达序列标签。应用荧光定量PCR方法对其中5个差异基因进行了鉴定，Telethonin、SPP1基因在30月龄延边黄牛阉牛背最长肌中的表达量显著高于8月龄。MYH7、MSTN和Camk2d基因在8月龄延边黄牛阉牛背最长肌中的表达量显著高于30月龄。初步筛选到Telethonin、SPP1、MYH7、MSTN和Camk2d等基因可能是调控延边黄牛阉牛肉质、生长性状的重要基因。

通过对筛选到的差异表达基因深入分析发现，参与细胞代谢的细胞因子信号负调控因子-8（ASB8）在8月龄延边黄牛阉牛背最长肌中表达上调。杨忠诚等[14]研究发现，咸宁黄牛SOCS4基因多态性与生长性状存在关联。本实验结果提示，ASB8基因可能与延边黄牛肌肉分化相关，该基因在延边黄牛生长发育过程中具有重要作用。钙/钙调依赖性蛋白激酶Ⅱ（Calcium/Calmodulin-Dependent protein Kinase II,CAMK II）是一种体内广泛存在的丝氨酸/苏氨酸激酶，由α、β、γ、δ4种亚基组成。目前已发现，CAMK II基因参与多种细胞活动的调控[15]。钙/钙调依赖性蛋白激酶Ⅱδ亚基（Camk2d）是该家族成员之一，在体内广泛表达[16]。刘勇等[17]研究发现，Camk2d基因在大鼠脂肪组织中表达，参与了脂肪细胞分化的调控。肌内脂肪是影响牛肉品质的重要因素之一，脂肪含量的多少将影响牛肉的风味和嫩度。本实验发现，Camk2d基因在30月龄延边黄牛背最长肌表达量显著降低，提示该基因可能是影响延边黄牛肉质性状的重要基因。

基因与骨骼肌的构成密切相关。Telethonin是一种重要的肌节蛋白，在肌原纤维的组装过程中发挥重要的作用[18]。肌肉生长抑制素（Myostatin，MSTN）最显著作用是对骨骼肌的生长具有负调控作用，通过抑制动物成肌细胞的增殖和分化抑制骨骼肌生长发育。MSTN基因已被证实与动物生长性状密切相关。闵令江等[19]研究显示，山羊MSTN基因多态性与山羊肉用性状显著相关。梁春年等[20]研究发现，牦牛MSTN基因内含子2多态性与生长性状显著相关。目前，MSTN基因在动物肌肉发育过程中表达的变化已有研究报道。刘丹等[21]研究发现随着猪日龄增加，MSTN基因表达量显著下降。Nicholas等[22]研究发现Telethonin能够调节MSTN分泌，抑制MSTN的活性。本实验中Telethonin在30月龄延边黄牛阉牛肌肉中高表达，而MSTN基因低表达，提示以上2个基因在延边黄牛生长发育中发挥重要作用，但具体机制有待于进一步研究。在筛选到的差异表达基因中，将Telethonin和MSTN差异片段回收后进行测序，将测序获得的各个序列在NCBI网站上进行比对，共获得9条牛的cDNA序列，与8月龄阉牛相比，有6个基因在30月龄阉牛背最长肌中表达水平下调，3个基因表达水平上调。本研究对不同发育阶段延边黄牛阉牛背最长肌差异表达基因进行了初步筛选，为延边黄牛分子育种提供了理论基础。在实验中只通过20对ACP引物进行了差异基因的初步筛选，获得差异基因较少，下一步应进一步挖掘影响延边黄牛生长、肉质性状的基因。

[1] 张勇,孙璀. 钙调磷酸酶-活化T细胞核因子信号途径在骨骼肌细胞生长和发育中生理作用的研究进展[J]. 动物营养学报, 2011, 23(4):536-541.

[2] 贺花. 秦川牛肌肉生长发育相关基因和蛋白质的筛选及初步鉴定[D]. 杨凌: 西北农林科技大学, 2014.

[3] 秦立红. 草原红牛初生公牛与成年公牛背最长肌基因表达差异分析[D]. 长春: 吉林大学, 2010.

[4] 唐荣莉, 王峰, 张淼如, 等. 不同发育阶段蒙古牛肌肉组织差异表达基因的筛选[J]. 动物营养学报, 2012, 39(9):33-37.

[5] 恒聪聪, 许厚强, 陈伟, 等. 关岭牛MyoD基因在不同组织和时期中的表达分析[J]. 中国畜牧兽医, 2015, 42(4):782-788.

[6] 张小辉,高雪,许尚忠,等. 南阳牛肌肉发育过程中ⅠGF基因家族的表达变化研究[J]. 云南农业大学学报, 2012, 27(4): 515-521.

[7] 夏广军,金鑫,田万年,等. 延边黄牛甲状腺球蛋白基因的SNPs及其与生长性状的关联分析[J]. 中国畜牧兽医, 2014, 41(3): 188-193.

[8] 田万年, 张守发, 李香子, 等. 延边黄牛α-肌动蛋白基因多态性及其与生长性状的关联分析[J]. 中国畜牧兽医, 2011, 38(8): 153-157.

[9] 夏广军,严昌国,金海国,等. 延边黄牛TG基因多态性与胴体和肉质性状的关联分析[J]. 中国兽医学报, 2014, 34(3): 500-504.

[10] 田万年, 周悦, 李香子, 等. 延边黄牛Titin基因多态性及其与肉质性状的相关分析[J]. 中国畜牧兽医, 2013, 49(17): 19-21.

[11] Hwang Ⅰ T, Kim Y J, Kim S H,et al. Annealing control primer system for improving specificity of PCR amplif i cation [J]. Biotechniques, 2003, 35(6):1180-1184.

[12] 吴奎, 梁宏伟, 李忠, 等. 尼罗罗飞鱼雌雄鱼肌肉组织差异表达基因的筛选[J]. 水产学报, 2014, 38(3): 316-323.

[13] 贾锡伟, 沈冰玲, 张子平, 等. 利用引物退火控制技术克隆日本囊对虾性腺差异表达基因[J]. 台湾海峡, 2011, 30(3): 349-355.

[14] 杨忠诚, 龚俞, 杨永强, 等. 威宁黄牛SOCS4基因多态性及其与生长性状的关联分析[J]. 南方农业学报, 2015, 46(4): 687-691.

[15] 钟强. CaMKⅠⅠ蛋白的结构与功能关系研究[D]. 武汉: 华中农业大学, 2010.

[16] 朱志明, 强巴央宗, 陈国宏, 等. 鸡Camk2d 基因外显子15的SNP发现,检测及与经济性状的关联分析[J]. 畜牧兽医学报, 2006, 37(12):1259-1263.

[17] 刘勇, 郭锡熔, 潘晓勤,等. CAMKⅠⅠD基因在3T3-L1脂肪细胞诱导分化过程中的表达变化[J]. 现代诊断与治疗, 2004, 15(5): 266-269.

[18] Moreira E S , Wiltshire T J, Faulkne R G,et al. Limbgirdle muscular dystrophy type 2G is caused by mutations in the gene encoding the sarcomeric protein telethonin [J]. Nat Genet, 2000, 24 (2): 163-166.

[19] 闵令江,丰艳妮,李兰,等. 山羊MSTN基因多态性与主要经济性状的关联分析[J]. 畜牧兽医学报, 2015, 46(9):1515-1524.

[20] 梁春年,阎萍,刑成峰,等. 牦牛MSTN基因内含子2多态性与生长性状的相关性[J]. 华中农业大学学报, 2011, 30(3): 285-289.

[21] 刘丹, 苏玉虹. 中外猪种肌生成抑制素基因表达的发育性变化研究[J]. 安徽农业科学, 2011, 39(35): 21836-21837.

[22] Nicholas G, Thomas M, Langley B,et al. Titin-Cap associates with and regulates secretion of myostatin[J]. J Cell Physiol, 2002, 193:120-131.

Screening and Ιdentif i cation of the Dif f erentially Expressed Genes in Dif f erent Development Stages of Yanbian Steers Longissimus Dorsi Muscles

TⅠAN Wan-nian1,2, LⅠ Xiang-zi3, XⅠA Guang-jun3, JⅠN Xin3, YAN Chang-guo3*
(1. College of Animal Science, Jilin Agricultural Science And Technology College, Jilin Jilin 132101,China; 2. Key Lab of Preventive Veterinary Medicine in Jilin Province, Jilin Jilin 132101,China; 3. College of Agriculture, Yanbian University, Jilin Yanji 133002,China)

Annealing control primer (ACP) system was applied to find differentially expressed genes(DEGs) in the longissimus dorsi muscle between 8 and 30 months of age. Using 20 arbitrary ACP primers, we identif i ed and sequenced 9 DEGs. The expression patterns were conf i rmed for fi ve genes (Telethonin,MYH7, MSTN, Camk2dandSPP1) using realtime PCR. The expressions ofMYH7,MSTNandSPP1were higher in the 8 months old than that in 30 months (P＜0.05), The expressions of theCamk2dandTelethoninwere higher in the 30 months than that in 8 months (P＜0.05). All the DEGs were screened by ACP system, which may considered as the most important genes involved in growth and meat quality traits.Key words: Yanbian yellow cattle; Annealing control primer (ACP) system; Differential expression genes(DEGs); Real-time quantitative PCR

S823.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-03-040

2016-07-06；

2016-07-28

吉林省科技发展计划项目（20150623004TC）；吉林省重点学科培育项目（吉农院合字[2015]第x030号）；吉林农业科技学院种子基金项目（吉农院合字[2014]第Z07号）

田万年（1980-），男，吉林长春人，讲师，博士，主要从事动物遗传育种研究，E-mail:wannian2000@hotmail．com

* 通讯作者：严昌国（1960-），男，吉林延吉人，教授，主要从事黄牛育种研究，E-mail: ycg@ybu．edu．cn