Notch1基因在宫颈癌组织中的表达及临床意义

楼朝霞 梅丽娜 杜英⋆ 胡庆伟 赵清 邢建民

Notch1基因在宫颈癌组织中的表达及临床意义

楼朝霞 梅丽娜 杜英⋆ 胡庆伟 赵清 邢建民

目的 研究Notch1基因在不同宫颈组织中的表达，探讨其在宫颈癌发生发展中的意义。方法 分别采用免疫组化和荧光实时定量PCR检测27例子宫颈癌、33例宫颈上皮内瘤变和19例正常宫颈组织中Notch1基因的表达情况。结果 免疫组化检测Nocth1蛋白在宫颈癌、宫颈上皮内瘤变组及正常宫颈癌组的表达率分别为63.0%、45.5%、15.8%，组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；荧光实时定量PCR检测宫颈癌、宫颈上皮内瘤变组织及正常宫颈组织中Notch1 mRNA含量分别为（5.10±1.91）、（3.24±0.69）、（2.07±0.40），组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。宫颈癌Notch1mRNA的高表达与患者年龄、组织学分级、临床分期差异均无统计学意义（P＜0.05）。结论 Notch1mRNA的高表达与宫颈组织的恶变演进有关，在子宫颈癌的发生、发展上起重要作用。

Notch1 宫颈癌 荧光实时定量PCR 免疫组化

宫颈癌是妇科三大恶性肿瘤之一，全国宫颈癌患者数逐年增加，且患病妇女呈年轻化的趋势。因此宫颈癌的早期诊断、早期治疗显得非常重要［1］。寻找新的肿瘤标记物和治疗靶点已成为基础研究者和各级临床医师关注的一个焦点。目前大量研究证明Notch信号通路作为致瘤因素与多个系统的肿瘤发生相关，同时，其又在某些组织的肿瘤发生中起到抑瘤作用［2-3］。Notch1信号转导通路与肿瘤之间关系密切，但其与宫颈癌的相关研究国内报道尚少［3-4］，因此本资料通过免疫组化与RT-PCR技术检测Notch1信号转导通路在不同宫颈组织中的表达情况，结合相关的临床病理资料，进一步探讨与宫颈癌发生发展之间的关系。

1 临床资料

1.1 一般资料 收集2010年1月至2014年5月本院的手术新鲜标本，分为子宫颈癌组（27例）、宫颈上皮内瘤变组（CIN）（33例）和正常对照组（19例）。宫颈癌临床诊断按国际妇产科联盟（FIGO）手术病理标准（其中Ⅰ期14例，Ⅱ期8例，Ⅲ期5例）。宫颈癌标本术前均未经化疗、放疗及免疫治疗等。

1.2 方法 （1）组织制备：从活体上取下的组织（250～500mg）在15min内用液氮浸没以便迅速降温，液氮运输。体积较小的组织用RNA later保存，干冰运输。（2）Total总 RNA的提取（按R mirVana-RNA Isolation Kit（Applied Biosystem p/n AM1556的试剂盒进行操作）：加入10倍体积的lysis/binding buffer（1ml lysis/binding buffer/0.1g组织）匀浆器彻底混匀。加200μl氯仿，充分混匀，15000r/min离心5～7min。取上清液，置入1.5ml Eppendorf管加600μl氯仿，混匀，15000r/min离心5min。取上清液液，置入1.5ml Eppendorf管加500ul异丙醇，混匀，15000r/min离心10min。弃上清液，用75%乙醇1ml冲洗，高速离心5min。弃上清液，RNA沉淀于空气中干燥（2～3min）。将干燥后的RNA溶解于DEPC处理水中，于-80℃冰箱保存。（3）颈环逆转录引物及荧光探针引物设计与合成：数据库中各目的基因的序列（NM_017617），引物由ABI公司的Primer Express Software v2.0设计，由公司合成；DEPC由美国Sigma公司生产。在共焦显微拉曼光谱仪（Renishaw 1000）上检测荧光。逆转录过程严格按照试剂盒进行。（由Invitrogen提供）。上游引物：TCCAGCAGTCTCCGTCCGTG；下游引物：GGACCCGCCCACAGTGAAAT。（4）特异mRNA的荧光定量PCR技术的建立及优化荧光PCR：采用SYBRGreen 荧光染料做常规实时定量PCR，ABI Vii7 realtime PCR system实时检测荧光强度的变化。PCR反应体系：H2O6.4μl，KAPA SYBR FAST Qpcr Master Mix（2×）8μl，Primer（up10pM/ul）0.2μl，Primer（down10pM/ ul）0.2μl，Template（就是反转录产物，也即cDNA）1μl，ROX0.2μl。反应条件为95℃预变性 2min，94℃变性 10s，60℃ 退火10s，72℃ 延伸45s，循环50次，最后72℃ 终末延伸10min，4℃保存后再分析结果。扩增完毕后根据荧光曲线计算相对比值。（5）正常组织mRNA及癌组织检测：采用共焦显微拉曼光谱仪（Renishaw 1000）进行检测荧光。氩离子激光器488 nm 线为激发光源，背反式为其检测方式。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，组间比较采用t检验，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化结果 Notch1在宫颈癌、CIN组、正常对照组的表达率，见表1。Notch1在不同宫颈组织中的表达情况，见图1。

表1 宫颈癌、CIN组与正常对照组的Notch1免疫组化表达率（n）

图1 Notch1在不同宫颈组织中的免疫组化表达情况

2.2 实时定量PCR结果 总RNA提取经电泳扫描分析可见清晰完整的两条条带，所提取的RNA符合实验要求。根据宫颈癌细胞株的内参，建立 Notch1的标准曲线。宫颈癌组织中Notch1 mRNA的含量（5.10±1.91），CIN中的含量（3.24±0.69），正常对照组则是（2.07±0.040）。统计学分析宫颈癌组和CIN组织中Notch1 mRNA的含量明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。宫颈癌组和CIN组比较Notch1 mRNA的含量，差异有统计学意义（t=-1.858，P＜0.05）。

2.3 子宫颈癌组不同的组织分型和临床分期Notch1的表达 见表2。

表2 研究组不同组织分型和临床分期Notch1 mRNA的表达情况

3 讨论

Notch基因首次发现于1917年，其突变可以造成果蝇的残翅，1983年Artavanis Tsakonas研究组首次克隆了该基因［2］。Notch信号通路在进化上相对保守，其家族的受体和配体通过局部细胞间的相互作用调节无脊椎和脊椎动物个体的发育和内环境稳定［2-3］。Notch信号通路的主要途径表现在：当Notch受体与配体结合后，活化的Notch受体直接转至核内，与转录调节因子结合而激活靶基因，其过程并不需要第二信使，但是其有多种配体共同存在；激活Notch可引发多种信号；多种调节因素可通过不同机制调节Notch信号。同时，研究发现Notch对个体细胞的作用效应（诱导增殖或生长停滞、促进或抑制分化等）与信号通量和细胞所处环密切相关［4-5］。目前研究，高危乳头状瘤病毒（HPV）感染及持续表达E6/E7癌基因与宫颈癌的发生高度相关，活化的Notch 1信号路径能协同E6/E7导致癌肿形成。在HPV阳性的宫颈癌细胞中，低水平表达的Notch 1 IC能促进肿瘤生长，而持续激活Notch 1信号却能诱导肿瘤细胞生长抑制。在正常宫颈上皮，Notch1表达较低，而在宫颈癌细胞中高表达，提示Notch 1信号的激活在宫颈癌发生发展中起重要作用［6-7］。Talora等［8］发现HPV癌细胞可将低水平的Notch 1信号表达成抗凋亡反应的同时能将激活的部分Notch 1信号去除。说明能通过改变细胞环境抑制肿瘤细胞的生长，为宫颈癌的基因治疗开辟新的方法。

Notch信号传导通路作为药物靶点通过深入研究疾病发生的分子机制与Notch信号传导通路的关系，以Notch信号传导通路作为药物靶点进行治疗研究，可以达到治疗相关疾病的目的［9］。如今，Notch信号传导的活化已证明与多种肿瘤的发生发展有关，治疗与Notch相关的肿瘤，可以将Notch信号传导通路作为选择性杀死肿瘤细胞的活性靶点，通过阻断Notch信号抑制肿瘤细胞的增殖，针对Notch受体的单克隆抗体（mAbs）也可以作为抑制剂阻断Notch信号通路，已证明兔抗rh11-12的mAbs可以有效地阻断3T3 L1细胞的分化［10-11］。

本研究通过使用免疫组化及RT-PCR技术分析不同宫颈组织中NOTCH1基因的表达状况，发现NOTCH1的基因表达水平在正常宫颈组织、CIN及宫颈癌中呈上升趋势，差异具有统计学意义（P＜0.05）。说明随着疾病的发生，NOTCH1基因的表达水平逐渐升高，NOTCH1基因参与了在宫颈癌的早期发生过程，对宫颈癌的早期预防具有重要意义。同时研究发现NOTCH1基因的表达状况与有关生物学标记物的关系，即在组织分级中，分化程度越低、NOTCH1基因表达的平均水平越高，而在临床分期中，级别越低，NOTCH1基因表达的水平越高，说明NOTCH1基因在宫颈癌的演变过程中亦起到非常重要的作用，。虽然Notch1mRNA的高表达与患者年龄、组织学分级、临床分期的差异不明显，但其表达的统计学意义可能受限于样本量的缺乏，还有待扩充样本量进一步研究。

［1］ 万磊,万建平,张燕玲,等.子宫颈癌年轻化趋势的临床分析.中国肿瘤临床,2004,31(10):547-549.

［2］ Artavanis-Tsakonas S,Rand MD,Lake RJ.Notch signaling: cell fate control and signal integration in development.Science, 1999, 284(5415):770-776.

［3］ Kojika S, Griffin JD. Notch receptors and hematopoiesis.Exp Hematol, 2001,29(9):1041-1052.

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［5］ Sitnik K,Cichy J.Role of Cre-loxP-mediated conditional gene targeting in understanding the function of Notch receptors.Postepy Biochem,2006,52(1):49-55.

［6］ Roy M,Pear WS,Aster JC.The multifaceted role of Notch in cancer.Curr Opin Genet Dev,2007,17(1):52-59.

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［8］ Talora C,Cialfi S,Segatto O,et al.Constitutively active Notch1 induces growth arrest of HPV-positive cervical cancer cells via sep-arate signaling pathways, Exprimental cell Research, 2005, 305(2):343-354.

［9］ Zlobin A,Jang M,Miele L.Toward the rational design of cell fate modifiers:Notch signaling as a target for novel biopharmaceuticals. Curr Pharm Biotechnol, 2000,1(1):83-106.

［10］ Bertelsen BI,Steine SJ,Sandvei R,et al.Molecular analysis of the PI3K-AKT pathway in uterine cervical neoplasia:frequent PIK3CA amplification and AKT phosphorylation.Int J Cancer, 2006, 118(8):1877-1883.

［11］ Purow B.Notch inhibition as a promising new approach to cancer therapy.Adv Exp Med Biol,2012,727:305-319.

Objective This study aimed to determine the expression profiles of Notch1 gene in different tissues of the cervix，including cervical carcinoma，cervical intraepithelial neoplasia and normal endometrium，and to examine explore its significance in cancer development occurs. Methods Immunohistochemistry and fluorescence quantitative PCR（RT-PCR）were used to detect the expression of Notch1 genes in 27 cases of cervical cancer，33 cases of cervical intraepithelial neoplasia（CIN）and 19 cases of normal cervical tissue. Results Immunohistochemistry showed the expression of Nocth1 protein in cervical cancer，cervical intraepithelial neoplasia and normal cervical group was respectively 63.0%，45.5%，15.8%，the difference between the two groups were statistically significant（P＜0.05）；real-time PCR detection the Notch1 mRNA contents of cervical cancer，cervical intraepithelial neoplasia and normal cervical tissues were 5.10±1.91，3.24±0.69，2.07±0.40，differences between groups were statistically significant（P＜0.05）. The relation of the high expression of Notch1mRNA is related to the age，histological grade，clinical stage（P＜0.05）. Conclusions The high expression of Notch1mRNA in cervical tissue is related to the occurrence of the malignant evolution and play an important role in the development of cervical cancer.

Notch1 Cervical carcinoma Real-time quantitatie polymerase chain reaction（RT-PCR） Immunohistochemistry

浙江省人口及计划生育项目［（2011）50号］

313000 浙江省湖州市妇幼保健院妇产科

*通信作者