枯草芽孢杆菌对SPF鸡肠道菌群的影响

赵效南，叶超群，常维山

（山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271000）

枯草芽孢杆菌对SPF鸡肠道菌群的影响

赵效南，叶超群，常维山*

（山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271000）

研究选用枯草芽孢杆菌作为益生菌，将其添加在基础日粮中，来评估其对10日龄SPF鸡肠道菌群的影响。将SPF鸡24只随机分为两组：枯草芽孢杆菌处理组（A组）和正常对照组（B组），连续饲喂7 d，收集各组盲肠内容物，采用高通量测序技术对各组SPF鸡盲肠内容物菌群进行分析。结果表明，A组盲肠内容菌群物种多样性高于B组，A组盲肠内容物菌群中有益菌所占的比例（8%）高于B组（2%），试验表明，枯草芽孢杆菌能够通过调节肠道菌群，增加肠道微生物的多样性，抑制有害菌的生长，促进有益菌的生长。

SPF鸡；枯草芽孢杆菌；肠道微生物；高通量测序

益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，其可以定植在人和动物的肠道，从而对宿主产生有益作用的微生物，主要包括芽孢杆菌、粪肠球菌、乳酸菌等[1]。益生菌具有调节肠道微生物区系平衡、增强机体免疫力、产生生物活性物质、抑制病原菌和病毒的作用等[2]。

肠道是动物用来消化食物吸收营养的主要部位，每g肠道内容物中含100亿个细菌，对动物的营养吸收、生长代谢和免疫抗病等方面发挥着重要的作用，其结构组成与多样性是影响宿主健康的重要因素[3-5]。动物肠道内菌群中有益微生物与有害微生物的种类及数量长期处于动态平衡的状态，肠道微生态才能得以维持，若正常菌群的种类、数量和比例发生变化，有害菌占多数，会破坏肠道菌群的平衡，从而对宿主肠道功能产生不利影响[6-7]。

分析肠道中微生物组成的多样性有助于了解宿主与菌群间相互作用关系，并对益生菌的研究和开发提供依据[8-9]。传统的方法主要是通过对微生物的分离培养、生化鉴定来对微生物进行表观的研究，但并不能进行更加深层次的了解，并且肠道菌群中还有1%～10%为非培养菌，因此利用传统的方法对细菌进行研究比较局限[10-11]。近些年，利用16SrRNA基因克隆文库测序，变形梯度凝胶电泳DGGE，末端限制片段长度多态性T-RFLP等来分析微生物群落的多样性[12-14]。但常规分子生物学技术只能检测到少量的优势菌群。相对而言，高通量测序具有测序通量高、准确度高、实时检测等较为明显的优势，显著拓宽了微生物生态学研究的广度和深度，已广泛应用于分子生物学领域[15-17]。

新生雏鸡的肠道几乎是无菌的，肠道免疫功能相对不成熟，以上两个因素促进了致病菌在雏鸡肠道内存活和定植，使得新生雏鸡易患肠道疾病。为预防肠道疾病的发生，益生菌在家禽业的应用得到了发展。已有多项研究表明，芽孢杆菌的摄入会降低病原菌的水平，而促进有益菌的生长[18]。因此本试验通过对SPF鸡饲喂枯草芽孢杆菌，采用高通量测序技术对SPF鸡肠道菌群进行分析，以探究枯草芽孢杆菌对肠道菌群的影响。

1 材料和方法

1.1 试验动物

试验动物为10日龄SPF鸡，体重差异不显著（P＞0.05），由济南斯帕法斯家禽有限公司提供。

1.2 材料与试剂

枯草芽孢杆菌（山东农业大学细胞免疫实验室保存）；粪便基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）。

1.3 仪器与设备

YXQ-LS-50G立式压力蒸汽灭菌器购自上海科晓科学仪器有限公司；SW-CJ-1G超净工作台购自江苏净通净化设备有限公司；TDZ5-BP离心机购自长沙湘锐离心机有限公司；YQX-Ⅱ厌氧培养箱购自上海新苗医疗器械制造有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 枯草芽孢杆菌菌液的制备

将枯草芽孢杆菌于MRS培养基37℃厌氧培养24h，计数并将芽孢杆菌配制成菌悬液（107cfu·mL-1）。

1.4.2 动物的饲养与管理

将SPF鸡分为试验组和对照组，每组12只。试验组为A组，对照组为B组。试验组每天在基础日粮中添加5 mL（107cfu·mL-1）的枯草芽胞杆菌菌悬液，连续饲喂一周，对照组正常饲喂基础日粮。

1.4.3 SPF鸡盲肠内容物的收集

在第7天，利用断颈的方式处死SPF鸡，无菌收集各组鸡只的盲肠内容物，每组12只，然后把每组的盲肠内容物混合在一起，各组取混匀物2 g加入30 mL的无菌PBS（pH=8.0）振荡均匀，并将悬浊液离心15 min，连续清洗沉淀两次，最后用来提取样品DNA。

1.4.4 DNA提取和测序

采用粪便基因组DNA提取试剂盒提取各组SPF鸡盲肠内容物样品的DNA，干冰条件下运送到北京百迈克生物科技有限公司，通过16SrDNA V3～V4区引物扩增各样品，通过barcode区分样品序列，对样品进行Alpha多样性分析。

2 试验结果

2.1 菌群多样性分析

OUT是通过提取样品的总基因组DNA，利用16sRNA或ITS的通用引物进行PCR扩增，通过测序以后就可以分析样品中微生物多样性，每个OUT对应于一个不同细菌（微生物）种。通过OUT分析就可以知道样品种微生物多样性和不同微生物的丰度。各组肠道菌群样品OUT稀释曲线见图1。从图1可知，饲喂枯草芽孢杆菌组（A）粪便中微生物物种的丰度大于对照组，表明饲喂益生菌有助于增加肠道菌群物种的丰度。

图1 各组肠道菌群样品OUT稀释曲线

各组肠道菌群样品的Shannon-Wiener曲线见图2。Shannon-Wiener曲线反映样品中微生物多样性的指数，利用各样品的测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建曲线，以此反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性。从图2可知，饲喂枯草芽孢杆菌组（A）盲肠内容物微生物的多样性大于对照组（B）盲肠内容物微生物多样性。

图2 各组肠道菌群样品的Shannon-Wiener曲线

2.2 菌群构成分析

各组样品在菌科和菌属水平上的相对丰度见图3～4。

图3 各组样品在菌科水平上的相对丰度

图4 各组样品在菌属水平上的相对丰度

由图3可知，A组样品的菌群以瘤胃球菌科为主。B组样品的菌群以拟杆菌科为主。

由图4可以看出，A组在属水平上，以巨单胞菌属为主。B组样品的菌群以拟杆菌属为主。其中A组的乳酸菌属所占的比例高于B组乳酸菌属所占的比例。

3 讨论

消化道微生物组是一个物种数量巨大且处于动态的生态系统，与宿主存在互利共生、同食共生和致病性的关系，不仅为机体生长提供多种营养物质、抑制病原菌的定植，同时对肠道的形态、免疫系统的发育、消化吸收和基因的表达调节等方面发挥重要作用[19]。利用高通量测序对盲肠内容物菌群多样性的分析结果表明，添加枯草芽胞杆菌能够增加菌群的多样性，微生物群体的多样性可以抑制有害菌的生长，生态学理论推测菌群种属的多样性，能够降低有害菌的侵袭，由于细菌只能利用有限的途径侵入机体，因此枯草芽孢杆菌可以调节肠道微生物的生态平衡，增加肠道菌群的多样性[20]。

本研究在菌科和菌属水平上，A组即添加益生菌组以瘤胃球菌科、巨单胞菌属为主，这一结果与Li等报道的结果相一致，即在肉鸡饲料中添加枯草芽孢杆菌CGMCC 1.1086，不仅能够促进肉鸡的生产性能，还能改变肉鸡的肠道微生物，通过对肠道微生物进行高通量测序，结果表明，添加枯草芽孢杆菌CGMCC 1.1086组肠道微生物以瘤胃球菌科、巨单胞菌属为主，同时瘤胃球菌科能够增加葡萄糖的代谢和纤维素的消化吸收[21-22]。B组即正常对照组以拟杆菌科、拟杆菌属为主，拟杆菌属是引起肠道疾病重要的病原菌，能够引起败血症等。其中A组的乳酸菌属所占的比例高于B组乳酸菌属所占的比例，与齐博等研究结果相一致，即枯草芽孢杆菌可改善肉仔鸡肠道形态，增加肠道中乳酸菌数量，促进肉仔鸡生长[23]。

枯草芽孢杆菌能够促进乳酸菌等其他有益菌的生长，可能由于枯草芽孢杆菌是需氧菌，进入消化道后能迅速消耗氧气，促进乳酸杆菌厌氧性有益菌的繁殖，抑制大肠杆菌等需氧型有害菌的增殖，此外，枯草芽孢杆菌能产生具有生物活性的抗菌物质（脂肽类、肽类等），对病原菌具有抑制作用[24-25]。表明基础日粮中添加枯草芽孢杆菌能改善肠道菌群的分布、抵制有害菌的生长、提高有益菌的比例并促进家禽机体健康生长。

4 结论

本试验研究表明，枯草芽孢杆菌能够有效的改善盲肠微生物菌群的分布，使瘤胃球菌科、巨单胞菌属的比例升高，并促进其他有益菌的生长。

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Effect ofBacillus Subtilison The Intestinal Microbiota of SPF Chickens

ZHAO Xiaonan,Ye Chaoqun,Chang Weishan*

（College of Animal Science and Technology,Shandong Agricultural University,Taian 271000,Shandong China）

In this study,as a probiotic bacterium,Bacillus subtilis was administered in diet and its effects on the ceacal microbiota of 10 d SPF chickens were evaluated.A total of 24 SPF chickens were randomly allcated into two treatment groups of basal diet containing B.subtilis(A)and basal diet without any addition of probiotics(B).MiSeq high-throughput sequencing analysis of 16SrRNA was used to investigate the bacterial community structure in the caeca of SPF chickens.The results indicated that the species diversity of A group was higher than that of group B and the relative abundance of intestinal microbiota were higher(8%)than those of control(2%)in the caeca of SPF chick⁃ens fed with B.subtilis.The probiotic B.subtilis could effectively modulate caecal microbiota and promote the grow of theprobiotics.The results of this study promoted application of probiotics in poultry industry.

SPFchickens;Bacillus subtilis;intestinal microbiota;MiSeq high-throughput sequencing

S816.46；S816.6

A

1001-0084（2017）02-0001-04

2017-01-02

赵效南（1987-），女，山东菏泽人，博士，主要从事微生态制剂研究。

*通讯作者：E-mail:1651512031@qq.com。