液体创口贴的细胞毒性检测方法探讨

严小莉高静贤刘茜王莎莎杨宇民

液体创口贴的细胞毒性检测方法探讨

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目的 应用浸提液试验（MTT比色法）和直接接触试验两种方法对液体创口贴的细胞毒性进行检测。方法 考虑到液体创口贴的有效使用状态为成膜制品，故将液体创口贴室温下成膜于培养皿上再加入细胞培养液进行浸提。结果 这两种试验方法在低浓度（0．125 g/皿、0．2 5 g/皿和0．5 g/皿）时结果基本一致，而高浓度（1 g/皿和2 g/皿）时差异较大。结论 在实际检测时，需明确检验方法及样品浓度。

液体创口贴；细胞毒性；直接接触法；MTT比色法

液体创可贴是近年来新出现的有别于传统绷带创可贴的新型创可贴。由于液体创口贴是直接与伤口创面接触的，故需对其进行生物学评价[1]。而体外细胞毒性实验具有操作简单、易标准化、周期短、敏感性强且能定量分析等优点，是医疗器械生物安全性评价体系中最重要的检测指标之一[2]。现选择了两类细胞毒性试验方法：浸提液试验（MTT比色法）和直接接触试验，依据GB/T16886.5-2003和ISO 10993.5-2009标准中的方法进行了试验[3-5]。浸提液试验是目前检测中最常用的细胞毒性检测方法，但是在GB/T 16886.12-2005和ISO 10993.12-2012中只规定了固体类材料的样品浸提制备方法，对于液体类的没有明确的规定[6-7]。而浸提液的制备对于检测结果的影响是非常大的，试验中考虑到液体创口贴的有效使用状态为成膜制品，故让液体创口贴室温下成膜后再加入细胞培养液进行浸提。通过两种试验方法的比较对液体创口贴的细胞毒性检测方法进行了探讨。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验细胞选取L929小鼠成纤维细胞株，购自中国科学院上海细胞所。主要药品与试剂：RPMI1640培养液（GIBCO，USA），胎牛血清（杭州四季青生物工程公司），MTT（AMRESCO，USA），DMSO（AMRESCO，USA）。液体创口贴随机取样于同一厂家送检的同批次产品。

1.2 方法

1.2.1 直接接触法 分别取2 g、1 g、0.5 g、0.25 g和0.125 g液体创口贴置于培养皿（直径9 cm）中，轻轻转动培养皿，使其均匀铺于培养皿中，室温晾干后，分别加入10 ml浓度为1×104U/ml的细胞悬液，取空白培养皿作为阴性对照，置于37℃、5% CO2培养箱中培养，于24 h、48 h和72 h取出培养皿，置倒置相差显微镜下观察细胞形态，并拍照。

1.2.2 四唑盐（MTT）比色法 分别取2 g、1 g、0.5 g、0.25 g和0.125 g液体创口贴置于培养皿（直径9 cm）中，轻轻转动培养皿，使其均匀铺于培养皿中，室温晾干后，分别加入10 ml含10%胎牛血清的RPMI1640培养液。置于37℃放置24 h制备浸提液。取高密度聚乙烯浸提液作为阴性对照品；5%的DMSO溶液作为阳性对照。将培养至近汇合的L-929细胞消化，稀释为1×104U/ml的细胞悬液，接种至96孔培养板，每孔加入100 µl。在37℃、5% CO2培养箱中培养24 h后，移除每孔中原培养液。空白对照组加新鲜培养液200 µl，各组分别加样品浸提液、阴性与阳性对照样品浸提液200 µl，置CO2培养箱中继续培养。培养72 h后将培养板取出，置倒置显微镜下观察细胞形态。每孔加入质量浓度为5 g/L的MTT溶液20 µl，继续培养4 h后移除孔内液体，加入200 µl DMSO，置振荡器上振荡10 min，选择570 nm在ELX800UV型酶标仪上测定光密度（optical density，OD）值，按公式计算相对增殖率（relative growth rate，RGR）：RGR=试验组吸光度值/对照组吸光度值×100%。

1.3 数据处理

用计算机统计软件包Statistica对数据作Students’t检验，数据采用（Mean±SEM）表示，确定差异显著性。

2 结果

2.1 直接接触法

共培养24 h后，0.125 g/皿、0.25 g/皿和0.5 g/皿三组的L929细胞能贴壁于膜上生长，细胞形态呈长条梭形或不规则多边形，1 g/皿和2 g/皿的细胞变圆或裂解死亡，未能贴附生长。随着培养时间的增加，0.125 g/皿、0.25 g/皿和0.5 g/皿三组的L929细胞大量增殖，共培养72 h后，0.125 g/皿和0.25 g/皿两组视野内细胞数量差别不大，0.5 g/皿组的细胞数量较之前两组较少，1 g/皿和2 g/皿的细胞已死亡殆尽，见图1。

2.2 MTT（四唑盐）比色法

表1为各浸提比例浸提液的细胞相对增殖率。结果显示：随着浸提比例的增加，细胞的相对增殖率越来越低。

3 讨论

液体创可贴属于生物成膜型生物制品，将其喷涂或涂抹在创面能快速干燥并形成透气、防水、柔软且有弹性的保护膜。它具有隔菌、透气、防水、使用方便、易于观察伤口情况及促进伤口恢复等特点[8]。不含药物的液体创可贴属于医疗器械范畴，按照国家医疗器械的分类规则，其属于Ⅱ类医疗器械产品[9]。国家对Ⅱ类医疗器械产品是进行注册管理的。在现行的国家标准以及行业标准中，还没有针对液体创口贴的相关标准。目前其在注册申请时都是依据企业提供的产品技术要求或是委托书进行检测，没有统一的行业标准。随着此类产品申请注册企业的增多，为保证其使用的安全性，建立合适的检验方法体系进行生物学评价是必要的步骤。而体外细胞毒性试验是生物学评价中不可或缺的一项试验，是评价医疗器械产品毒性反应的一项重要指标。

试验中选择了直接接触法和浸提液法对液体创口贴的细胞毒性进行了检测。在进行浸提液制备时，如果将液体创口贴直接加入细胞培养液制备浸提液，会形成絮状物，无法进行试验。考虑到它的有效使用状态为成膜制品，故在进行试验时都是将其先晾干成膜，再进行检测。

GB/T16886.5-2003标准中规定了直接接触法的试验步骤：是将细胞培养到近汇合的状态，再将样品置于细胞上方，共培养后观察样品下方以及周围细胞生长状态，进行分类分级。本试验中由于样品成膜后较轻，如果将膜置于细胞上方会漂浮在培养液中，无法固定，从而无法进行后期观察。故在进行本试验时，是将液体创口贴直接成膜贴附于培养皿中，再将细胞悬液接种于培养皿中。结果显示：0.125 g/皿、0.25 g/皿和0.5 g/皿三组的L929细胞能贴壁于膜上生长，且随着共培养时间的增加，视野内的细胞数量也增加，这与MTT比色法的结果一致。1 g/皿和2 g/皿组在直接接触法中细胞在24 h未能贴附生长就已死亡殆尽，但在MTT比色法中这两组细胞增殖率分别为54.6%、40.4%。这两组结果直接接触法的细胞毒性高于MTT比色法，分析原因可能是MTT比色法中细胞是贴附生长后再加的浸提液，因而浸提液中的毒性物质对细胞的增殖影响较大，对细胞的贴壁影响不大；直接接触法是细胞悬液直接加入到膜上，样品释放的毒性物质使得细胞不能贴壁，也就不能增殖生长。

表1 各浸提比例浸提液的细胞相对增殖率

图1 L-929细胞与各比例的液体创口贴膜共培养24 h、48 h和72 h后的细胞形态（倒置相差显微镜，×400）

综合这两种方法的检测结果，这两种细胞毒性检测方法都能适用于液体创口贴的检测。但由于这两种检测方法的原理不同，对检测结果也有很大的影响。而且样品浓度的选择也会直接影响检测的结果。此外，国内液体创可贴尚未有国家标准和行业标准进行质量控制，都是企业内部技术要求，产品质量参差不齐，需要制定相关行业标准进行管理控制。现行的国际、国家标准只是对医疗器械生物学评价给出了笼统的指导原则，并没有实际的针对性[10]。因此在实际的医疗器械检测过程中，需要我们检测人员根据医疗器械产品的特性，探寻出合理有效地检测方法，以期达到有效地评价医疗器械产品细胞毒性的目的。

[1] GB/T16886．1-2011． 医疗器械生物学评价第1部分风险管理过程中的评价与试验[S]． 2011．

[2] 高静贤，王莎莎，金梦，等． 医用超声耦合剂体外细胞毒性检测的探讨[J]． 中国医疗器械杂志，2013，37（3）：210-212．

[3] GB/T16886．5-2003． 医疗器械生物学评价第5部分体外细胞毒性试验[S]． 2003．

[4] ISO 10993-5：2009． Biological evaluation of medical devices-Part 5：Test for in vitro cytotoxicity[S]． 2009．

[5] 奚廷斐． 医疗器械生物学评价[M]． 中国标准出版社，2012：96-107．

[6] GB/T 16886．12-2005． 医疗器械生物学评价第12部分:样品制备与参照样品[S]． 2005．

[7] ISO 10993-12：2012． Biological evaluation of medical devices -Part 12：Sample preparation and reference materials[S]． 2012．

[8] 刘海霞，张爱军，张林． 液体创可贴的研究进展[J]． 中国医药科学，2016，6（4）：28-31．

[9] 国家食品药品监督管理总局． 医疗器械分类规则（国家食品药品监督管理总局令第15号）[S]． 2015．

[10] 孙皎． 医疗器械的生物学评价与风险探讨[J]． 中国医疗器械杂志，2006，30（5）：386-387，382．

Discuss the Vitro Cytotoxicity Test of Liquid Bandage

YAN Xiaoli1GAO Jingxian1LIU Qian1WANG Shasha1YANG Yumin21 Jiangsu Province Medical Instrument Testing Institute, Nanjing Jiangsu 210022, China; 2 Key Laboratory for Nerve Regeneration, Nantong University, Nantong Jiangsu 226000, China

Objective The cytotoxicity of liquid bandage was tested by MTT assay and direct contact. Methods Considering the using condition of liquid bandage, the sample was prepared to make extraction on the film formation. Results The results of the two tests were consistent at 0.125 g/plate, 0.25 g/plate and 0.5 g/plate. At 1 g/plate and 2 g/plate, significant different appeared in the tests. Conclusion The experimental condition and the preparative method of extraction should be determined.

liquid bandage; cytotoxicity; direct contact test; MTT assay

R446

A

1674-9316（2017）04-0112-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．04．071

国家自然科学基金课题（81371687）

1 江苏省医疗器械检验所，江苏 南京 210022；2 南通大学神经再生重点实验室，江苏 南通 226000