传染性造血器官坏死病病毒G基因全长cDNA克隆及重组表达研究

焦雪，卢玉婷，安俊花，张翔宇，张培军，李月红

(1．吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118;2．内蒙古乌兰察布市农牧业综合行政执法支队，内蒙古乌兰察布012000; 3．内蒙古乌兰察布市水产站，内蒙古乌兰察布012000;4．吉林省卫生检测检验中心，吉林长春130118)

传染性造血器官坏死病病毒G基因全长cDNA克隆及重组表达研究

焦雪1，卢玉婷1，安俊花2，张翔宇3，张培军4，李月红1

(1．吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118;2．内蒙古乌兰察布市农牧业综合行政执法支队，内蒙古乌兰察布012000; 3．内蒙古乌兰察布市水产站，内蒙古乌兰察布012000;4．吉林省卫生检测检验中心，吉林长春130118)

本研究旨在克隆G基因全长并与其他传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)株进行分析，为IHNV的预防检测提供依据。通过提取IHNV-G蛋白RNA并进行扩增，将其克隆到pMD-18T并与pChlamy-4载体相连，重组到莱茵衣藻中并提取总蛋白，结果可得:扩增片段长度为1 500 bp，经SDS-PAGE电泳得到一条大约为58 kDa的蛋白条带，Westen Blot分析结果显示，重组莱茵衣藻所表达的蛋白可以与6×HIS标签抗体特异性结合;并且以重组表达的G蛋白为抗原，鼠抗IHNV血清为一抗，辣根过氧化物酶标记的驴抗鼠IgG为二抗，再次进行Westen Blot检验，其结果显示，经诱导后的G蛋白能与鼠抗IHNV血清反应，并在58 kDa处出现了一条明显的特异性条带，具有良好的反应原性。表明重组莱茵衣藻表达系统构建成功。

传染性造血器官坏死病病毒(IHNV);糖蛋白;Western Blot

传染性造血器官坏死病病毒(Infectious Hematopoietic Necrosis Virus，IHNV)属弹状病毒科，诺拉弹状病毒属，主要感染鲑、鳟鱼。以肾脏和脾脏等造血组织坏死为主要特征［1］。该病毒主要通过水平传播感染宿主，幼鱼时期患病未死亡的带病鱼是IHNV的主要传播源［2］。其中，IHNV糖蛋白是病毒的主要抗原［3］，与病毒的毒力直接相关［4］，并且在细胞受体与病毒结合过程中起着十分重要的作用［5］。目前，对IHNV有效的防控措施是通过隔离病毒或是注射疫苗，但3月龄内的鱼苗其免疫器官未发育成熟，所以注射疫苗往往达不到理想的效果，本研究主要以研制出安全、可靠的新型载体口服疫苗为目的，从根本上断绝病毒的传播，为我国的冷水渔业健康发展提供一定的技术支持。

1 材料与方法

1．1 试验材料FHM细胞系分离培养的IHNV株细胞毒由吉林农业大学动科109实验室保存，重组莱茵衣藻由实验室构建并保存。

1．2 IHNV-G基因总RNA的提取取300 μL细胞毒加1 mL TRIZol室温孵育5 min，12 000 r/min (4℃)离心15 min后吸取上清，加入200 μL的氯仿震荡15 s，室温孵育5 min;12 000 r/min(4℃)离心15 min;吸取上层转置到一个新的EP管中，加入500 μL的异丙醇沉淀RNA，室温孵育10 min; 12 000 r/min(4℃)离心15 min;倒掉上清，加入1 mL 75%的乙醇洗涤2次，7 500 r/min(4℃)离心5 min;室温干燥5 min，加25 μL的无RNA酶处理水溶解并保存在－80℃。

1．3 IHNV-G基因cDNA的克隆以1 μL细胞毒为模板，按照宝生物工程(大连)有限公司提供的反转录试剂盒合成cDNA第一条链，引物根据NCBI数据库中已公开IHNV的HLJ-09株(登录号: JX649101)的G基因序列设计上下游引物，去掉终止密码子后在上游引物中引入EcoR I酶切位点和下游引物中引入Kpn I酶切位点如图2～4。IHNVG(F:5'-TAGATATCATGGACGCCATGATCAC-3';R: 5'-ATGGTACCTATTAGGACCTGTTTGCC-3')由上海生工生物工程技术服务有限公司合成;PCR反应条件为:94℃预变性5 min;94℃变性5 min;退火温度61Tm;72℃延伸1 min，35个循环;最后72℃延伸8 min，4℃保存。将PCR产物进行胶回收，按宝生物工程(大连)有限公司提供的胶回收试剂盒进行纯化，连接至DH5α中，挑取白色菌落扩大培养，按照质粒DNA小量提取试剂盒提取，用EcoR I酶、Kpn I酶进行双酶切，将阳性质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

1．4 序列分析及构建发育树将获得的DNA序列使用DNAStar软件进行同源性比对，使用MEGE5.2分析遗传进化关系构建系统进化树。

1．5 IHNV-G蛋白血清的制备抗IHNV全血清病毒的制备，取本实验室保存的IHNV细胞毒15 mL，按照2.5 μL/mL加入40%甲醛至终浓度0．1%，37℃温育48 h。加入等体积的弗氏佐剂混匀，采用腹腔注射，每只小鼠注射0.25 mL。每隔7 d免疫1次，第4次免疫后3 d眼球取血，每只小鼠眼球取血约0.7 mL，37℃水浴1 h，3 000 r/min(4℃)，离心10 min，最后血清量约350 μL左右置于－20℃保存。

1．6 Westen Blot将重组的莱茵衣藻表达蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后用蒸馏水冲洗3次，置于转膜缓冲液中平衡5 min准备转膜;转膜结束后，取出PVDF膜，做好标记，用PBS冲洗3次，置于5%脱脂奶中，4℃封闭过夜;次日，取出PVDF膜，用TBST漂洗3次，每次5 min，在加入1∶3 000稀释浓度的鼠源HIS标签抗体作为一抗，室温孵育5 h;TBST漂洗3次，每次5 min;加入1∶2 000稀释浓度的辣根过氧化物酶标记的驴抗鼠IgG作为二抗，37℃孵育1．5 h;TBST漂洗3次，每次5 min。按照DAB显示试剂盒进行显色，显色前将10 mL反应液，200 μL溶液A，100 μL溶液B，20 μL溶液C在棕色瓶中充分混匀，再将PVDF膜浸泡在其中，37℃条件下震荡反应5 min，弃去显色液后用蒸馏水冲洗3次，自然干燥后观察记录。

1．7 重组G蛋白的反应原性以重组表达的G蛋白为抗原，鼠抗IHNV血清为一抗，辣根过氧化物酶标记的驴抗鼠IgG为二抗，再次以Westen Blot试验测定G蛋白抗血清与病毒反应性。

2 结果与分析

2．1 IHNV-G基因总RNA提取结果待80%细胞出现明显病变，按照TRIZol试剂说明书操作提取细胞毒中FHM细胞和IHNV病毒的总RNA如图1。

图1 FHM细胞和IHNV病毒的总RNA

2．2 IHNV-G基因RT-PCR扩增以FHM细胞和IHNV病毒的总RNA为模板，反转录合成cDNA第一条链。再以cDNA作为PCR反应的模板，经特异性引物PCR反应后，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果如图2，得到一条1 500 bp左右大小的特异性条带。

图2 PCR扩增结果

2．3 IHNV-G基因系统发育树构建及分析将IHNV-G基因与多株IHNV参考株进行核苷酸同源性比较可得，IHNV-G基因与韩国株ChYa 07和PcKw11同源性较高，分别为97．8%和97．5%，其推导的氨基酸序列同源性为97．5%和98．2%。与其他参考株核苷酸同源性为94．8%～96．7%，推导出的氨基酸同源性为94．5%～95．8%。从G基因的进化树上看(图3)，CJ-13株G基因与韩国分离的2株相对较近，表明亚洲分离株与美国分离株、欧洲分离株进化关系较远，明显不在同一个进化分支上。

图3 G基因核苷酸进化树分析

2．4 IHNV-G基因重组用EcoR I和Kpn I消化pMD-18T-IHNV-G重组质粒和pChlamy-4载体，回收IHNV-G基因片段和pChlamy-4线性化载体片段，T4连接酶连接构建出表达载体。将表达载体化学转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞中进行扩增后提取质粒，进行双酶切，酶切产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行验证结果如图4，得到一条1 500 bp左右大小的特异性条带，说明线性化载体与目的片段连接成功，将质粒送至测序公司进行测序，测序结果同样证明载体与目的片段连接成功，插入片段进行同源性比对结果同源性为99%。

2．5 SDS-PAGE电泳分析结果转基因莱茵衣藻经两次抗性筛选后，离心收集转基因莱茵衣藻，超声波破碎莱茵衣藻提取粗蛋白，进行SDS-PAGE电泳，结果显示，有一条大约为58 kDa的蛋白条带(如图5)，与理论结果相符合。

2．6 Western blot检测结果以重组表达的目的蛋白为抗原，鼠源HIS标签抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记的驴抗鼠IgG为二抗，Western Blot结果显示，目的蛋白能与鼠源HIS标签抗体反应，在58 kDa处出现了一条明显的特异性条带，与SDS－PAGE出现的目的蛋白一致，如图6。

图4 PCR结果M1:λ-EcoT 14 I Marker;M2:250 bp DNA Marker 1:转基因莱茵衣藻基因组DNA;2:PCR结果

图5 pCh-IHNV-G在莱茵衣藻中表达产物的SDS-PAGE分析

以重组表达的产物为抗原，鼠抗IHNV血清为一抗，辣根过氧化物酶标记的驴抗鼠IgG为二抗，再次进行Western Blot检测，并在58 kDa处出现了一条明显的特异性条带(见图7箭头)，说明经诱导后的G蛋白能与鼠抗IHNV血清反应。

图6 Western Blot分析

图7 Western Blot分析

3 讨论

本试验以IHNV-G基因、莱茵衣藻为原料进行基因重组，免疫小鼠获得了鼠抗血清，并通过Western Blot进行免疫原性分析，结果表明，糖蛋白在莱茵衣藻中得到了表达，具有反应原性，但是表达量很低。其原因可能是由于莱茵衣藻的核基因组含有较高的GC碱基对，并具有较明显的密码子偏好性，密码子的第一位和第3位多数为G或C［6－7］，而本试验没有对糖蛋白基因进行密码子优化，可能是造成蛋白表达量低;其次基因在莱茵衣藻表达高低与启动子的选择和mRNA的稳定性有一定的关系［8］。Lumbreras等［9］的研究显示，RBCS2内含子的插入可提高ble基因的表达效率，由于RBCS2中含有转录增强元件;Schroda等的研究发现，HSP70A融合到RBCS2和NIT的上游时，可提高外源基因的表达，并减少“基因沉默”。本研究选用HSP70ARbc S2融合启动子和3'-UTR确保正常终止转录，保障外源基因的表达［10］。三是外界的原因，转基因莱茵衣藻的培养条件也会影响外源基因的表达，如抗生素的浓度，培养温度，光照强度等。本试验对转基因莱茵衣藻的培养沿用转基因前的条件，并未对其进行摸索，可能也是其表达量低的原因。

［1］St-Hilaire S，Ribble C S，Stephen C，et al．Epidemiological investigation of infectious hematopoietic necrosis virus in salt water netpen reared Atlantic salmon in British Columbia Canada［J］．Aquaculture，2002，212(1):49-67．

［2］Ammayappan，S E La Patra，V N Vakharia．Mo Lecu Lar characterization of the viru Lent infectious hematopoietic necrosis virus(IHNV)strain 220-90［J］．Viro Logy Journa L，2010，7:10．

［3］世界动物卫生组织(OIE)．水生动物疫病诊断手册［M］．3版．北京:中国农业出版社，2000:45．

［4］H Schutze，P J Enzmann，E Mundt，et al．Identification of the nonvirion(NV)protein of fish rhabdoviruses vira L haemorrhagic septicaemia virus and infections haematopoietic necrosis virus［J］．Gen Viro L，1996，77:1259-1263．

［5］J H Cox，B Dietzscho Ld，L G Schneider，et al．Rabies virus g Lycoprotein．II．Bio Logica L andsero Logica L characterization［J］．Infect Immuno Logy，1977，16(3):75-759．

［6］Kurath G，Garver K A，Corbeil S，et al．Protective immunity and lack of histopathological damage two years after DNA vaccination against infectious hematopoietic necrosis virus in trout［J］．Vaccine，2006，24(3):345-354．

［7］卢玉婷，王建超．传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)糖蛋白基因莱茵衣藻表达载体的构建［J］．中国兽医学报，2016，36 (11):5-9．

［8］杨星宇．含GFP基因的莱茵衣藻高效表达载体的构建及其在衣藻叶绿体中的表达［D］．青岛:青岛科技大学，2012．

［9］Jakubiec H．Studies on the Polish Chlamydomonadaceae［J］．Nova Hedwigia，1984，39:269-292．

［10］吉尚雷，卢玉婷．传染性造血器官坏死病病毒CJ-13株糖蛋白的原核表达及免疫原性［J］．西北农林科技大学学报(自然科学版)，2015(7):1-7．

Cloning and recombinant expression of cDNA gene of infectious hematopoietic necrosis virus G gene

JIAO Xue1，LU Yu-ting1，AN Jun-hua2，ZHANG Xiang-yu3，ZHANG Pei-jun4，LI Yue-hong1
(1．Jilin Agriculture University，College of animal science and technology，Changchun 130118，China;2．Agriculture and animal husbandry，Wulanchabu City，Inner Mongolia comprehensive administrative law enforcement detachment，Wulanchabu 012000，China;3．Fisheries Station of Wulanchabu City，Wulanchabu 012000，China;4．Jilin provincial health inspection and Testing Center，Changchun 130118，China)

This study aimed to clone the full-length G gene and compred with other IHNV strains to provide the basis for preventive detection of IHNV．IHNV-G gene was amplified and cloned into pMD-18T pChlamy-4 and was then connected to the carrier recombination into C．reinhardtii．The amplified fragment length was 1 500bp，and SDS-PAGE electrophoresis showed that the expressed protein was about 58KDa，Westen blot analysis showed that the recombinant protein expressed by C．reinhardtii specifically bound with a 6×HIS tag antibody;westen blot analysis also shaved that the recombinant G could reacted with mouse anti-serum IHNV．Our results indicate that the recombinant expression system reinhardtii is successfully constructed．

Infectious Hematopoietic Necrosis Virus;IHNV;Glycoprotein;Western blot

LI Yue-hong

S941

A

0529-6005(2017)01-0003-04

2016-04-13

国家自然科学基金(30972191);吉林省留学人员创新创业项目(201523);长春市农业先进实用技术的示范推广项目(20130215);农业部948项目(2014Z34)

焦雪(1992-)，女，硕士生，主要从事动物疾病及免疫研究，E-mail:455261939@qq．com

李月红，E-mail:liyhong@sina．com