一贯煎“异病同治”的网络药理学分析＊

杨梦蝶，蔡菲菲，武 容，陈晓乐，潘秋莎，胡元佳，苏式兵＊＊

（1.上海中医药大学中医复杂系统研究中心 上海 201203；2.澳门大学中药质量研究国家重点实验室 澳门 999078）

一贯煎（散剂）出自《柳洲医话》，是清代魏之秀之方，由北沙参（三钱）、麦冬（三钱）、当归（三钱）、生地黄（十钱）、川楝子（一钱半）、枸杞子（四钱）六味中药组成。本方重用生地黄，重滋补，轻柔肝理气，主治肝肾阴虚，肝气不舒之证。证见胸脘胁痛，吞酸吐苦，咽干口燥，舌红少津，脉细弱或虚弦。近年来，研究者们开展了一贯煎对多种疾病的临床和实验研究[1,2]，但其“异病同治”的疗效机制尚未解明。中药复方不同于天然药物或西药，是多成分、多靶点、多途径和多效应[3]的复杂系统。因此，需要适合的技术和方法来探讨中药复方的复杂作用机制。

网络药理学作为新兴的学科，是从系统生物学和生物网络平衡的角度阐释疾病的发生发展过程、从改善或恢复生物网络平衡的整体观角度认识药物与机体的相互作用并指导新药发现的[4]。其通过公共数据库和公开发表的数据，建立特定药物作用机制网络预测模型，或进行大通量检测获取相关信息，并采用生物信息学的手段分析和构建药物-靶点-疾病网络等，解析药物的网络药理学机制，预测潜在治疗疾病及相关作用靶点和通路等，在探索中药复方治疗疾病的作用机制和新药的发现有广阔的前景。本研究旨在通过网络药理学技术构建一贯煎成分-靶点-疾病网络，分析一贯煎的作用靶点、生物过程和通路，预测其治疗不同疾病肝肾阴虚证“异病同治”的机制及新的临床适应病症，并为发现新的药物提供线索。

1 方法

1.1 一贯煎成分、靶点及疾病查询与筛选

运用中药综合数据库TCMSP[5]（http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）、TCM database@Taiwan[6]（http://tcm.cmu.edu.tw）、TCMID[7]（http://www.megabionet.org/tcmid）、HIT[8]（http://lifecenter.sgst.cn/hit）以及化学数据库TTD（http://bidd.nus.edu.sg/group/TTD/ttd.asp）查找一贯煎中北沙参、麦冬、当归、生地黄、枸杞子、川楝子的所有化学成分。然后，在TCMSP和Drugbank[9]（http://www.drugbank.ca）中查找化学成分对应的靶点和疾病，去除无靶点对应的化学成分，删除重复的靶点和疾病。而且，运用PubChem[10]（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）寻找化学成分的别名。

1.2 口服生物利用度和类药性指数筛选

口服生物利用度[11,12]（Oral bioavailability，OB）是指经口服途径给药后药物吸收进入全身血液循环的相对量。它是药物特性中最重要的药代动力学参数之一。类药性指数[13]（Drug-likeness，DL）是化合物与Drug⁃bank数据库里已知药物的相似性。具有类药性的化合物并不是药物，但是具有成为药物的可能，这一类化合物称为类药性分子或药物类似物分子。本研究中，我们在TCMSP中找到各个化学成分的口服生物利用度（OB）和类药性指数（DL），并筛选出其中OB≥30%并且DL≥0.18的成分作为活性成分。

1.3 网络构建与数据分析

通过Uniprot[14]数据库（http://www.uniprot.org/）查找靶点的基因名称和编号，再运用Cytoscape[15]3.4.0软件构建：①一贯煎中药成分-靶点的网络：每个化学成分和其作用靶点通过直线连接起来；②一贯煎中药成分-靶点-疾病的网络：靶点与其对应的疾病通过直线连接起来，通过靶点，中药成分与疾病连接起来。网络图中代表化学成分、靶点、疾病的点称为节点。并运用Cytoscape3.4.0中的插件Network Analyzer分析两个重要拓扑参数：节点度（Degree）和中介中心度（Between⁃nessCentrality）。

1.4 通路分析

运用David[16]在线软件（https://david.ncifcrf.gov/）对一贯煎靶点的GO生物学过程（Gene Ontology Biologi⁃cal Process，GO-BP）和KEGG通路（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway，KEGG Pathway）进行富集分析。

2 结果

2.1 一贯煎化学成分筛选

经过五个数据库的查询，我们查找出各个中药含有化学成分分别为北沙参122个、麦冬95个、当归288个、生地黄71个、枸杞子212个、川楝子61个，其中有靶点对应并且有OB和DL值记录的北沙参化学成分有54个，麦冬11个，当归220个，生地黄37个，枸杞子199个，川楝子43个。经OB（≥30%）、DL（≥0.18）筛选后，一贯煎一共有活性成分49个（表1），其中北沙参7个，当归3个，生地黄1个，川楝子2个，枸杞子29个，另外异珊瑚菜素（Cnidilin）是北沙参、当归的共同化学成分，β共谷甾醇（beta-sitosterol）是北沙参、麦冬、生地黄、当归、枸杞子的共同化学成分，豆甾醇（Stigmaster⁃ol）是北沙参、麦冬、当归、川楝子、枸杞子的共同化学成分，槲皮素（quercetin）是北沙参、川楝子、枸杞子的共同化学成分，菜油甾醇（campesterol）是生地黄、枸杞子的共同化学成分，十八碳-6,9-二烯酸乙酯（Mande⁃nol）和亚麻酸乙酯（Ethyl linolenate）是川楝子、枸杞子的共同化学成分。

2.2 中药成分-靶点的网络构建与分析

在Drugbank和TCMSP数据库中查询筛选出的49个一贯煎活性成分，找到200个对应的靶点。运用Cy⁃toscape软件，构建一贯煎成分-靶点网络（图1A）。该网络中有417条边，代表成分和靶点的相互作用关系。网络中的249个节点里有49个代表成分，成分节点平均度为8.51，大于平均节点度的成分有9个成分；代表靶蛋白的节点为200个，其节点平均度为2.09，大于平均节点度的靶蛋白有30个。根据这9个成分和30个靶蛋白的相互关系，构建一贯煎成分-靶点核心网络（图1B）。

图1中浅蓝色三角代表北沙参独有成分；深蓝色三角代表当归独有成分；紫色三角代表生地黄独有成分；红色三角代表川楝子独有成分；黄色三角代表枸杞子独有成分；绿色椭圆代表北沙参、当归共有成分；浅蓝色椭圆代表北沙参、麦冬、生地黄、当归、枸杞子共有成分；深蓝色椭圆代表北沙参、麦冬、当归、川楝子、枸杞子共有成分；紫色椭圆代表北沙参、川楝子、枸杞子共有成分；红色椭圆代表生地黄、枸杞子共有成分；黄色椭圆代表川楝子、枸杞子共有成分；深蓝色方块代表靶点。

2.3 中药成分-靶点-疾病网络构建与分析

为了阐明一贯煎多成分、靶标以及疾病之间的相互关系，我们在TCMSP数据库中查找出靶点相关疾病264个，用Cytoscape软件，构建一贯煎成分-靶点-疾病网络（图2A），网络中有915条边，代表中药成分、靶点

个节点代表疾病，平均节点度为3.47，大于平均节点度的有28个疾病。我们分别筛选同时大于中介中心性（BetweennessCentrality）、接近中心性（ClosenessCen⁃trality）平均值和平均节点度的节点，并将两者一起与上述大于平均节点度的节点做交集，得到6个活性成分，包括松柏苷（coniferin）、阿托品（Atropine）、黄豆黄素（glycitein）、β胡萝卜素（beta-carotene）、β谷甾醇（be⁃ta-sitosterol）、豆甾醇（Stigmasterol），42个靶点，28个疾病。构建中药成分-靶点-疾病核心网络（图2B）。图中图标越大表示节点度越大，边线越粗表示边介数越大。

表1 一贯煎的活性成分

图1 一贯煎成分-靶点网络

图2 一贯煎中药成分-靶点-疾病网络

2.4 基于中药作用靶点的疾病预测

运用Cytoscape软件的NetworkAnalyzer工具分析一贯煎中药成分-靶点-疾病网络中疾病节点的网络拓扑参数，根据中介中心度和节点度筛选出前十五位疾病（表2），其中癌症是一贯煎显著相关的疾病，有13个靶点，包括前列腺素G/H合成酶2、细胞分裂蛋白激酶2、尿激酶型纤溶酶原激活剂、表皮生长因子受体、转录因子AP-1、间质胶原酶等。检索文献可以找到关于一贯煎用于治疗原发性肝癌[17]、肺癌[18,19]、乳腺癌[20,21]、炎症[22-24]、焦虑症[25]、抑郁症[25-27]、帕金森病[28,29]以及非胰岛素依赖型糖尿病[25]的报道，但尚未发现有关阿尔兹海默病、精神分裂症、心血管疾病、哮喘、骨关节炎、心肌梗死、类风湿性关节炎、疼痛以及慢性阻塞性肺疾病等的报道。此外，我们的预测还发现一贯煎可用于治疗可卡因等药物依赖性症状，这将对药物及毒品成瘾的戒断治疗提供思路。

表2 一贯煎中药成分-靶点-疾病网络的拓扑参数和文献来源

2.5 生物学过程及通路

通过DAVID在线软件对一贯煎的生物学过程和通路进行富集分析，得到533个GO生物学过程，KEGG通路有120条，表3分别列举了显著富集的前15个生物学过程：药物应答、RNA聚合酶II启动子转录的正调控、积极调节转录，DNA模板、缺氧的细胞应答、缺氧应答、老化、雌二醇应答、血管收缩的正调节、细胞增殖的正调控、基因表达的正调控、凋亡过程的负调控、脂多糖、对有毒物质的反应、炎性反应以及腺苷酸环化酶激活肾上腺素能受体信号通路，和前15条KEGG通路：癌症通路、乙型肝炎、前列腺癌、膀胱癌、TNF信号通路、胰腺癌、非小细胞肺癌、蛋白多糖与癌症、恰加斯病（美洲锥虫病）、结直肠癌、小细胞肺癌、HIF-1信号通路、利什曼病、子宫内膜癌以及甲状腺激素信号通路。

3 讨论

中药复方以“多成分、多靶点、多途径和多效应”为特征，被广泛用于治疗慢性复杂疾病，但在机理解释，特别是在分子水平上系统地评价疗效方面都具有挑战性[30]。近年来，随着网络药理学的发展，应用大量已经证实报道的数据及大通量检测的信息，将已知中药成分与疾病药物靶点联系起来，从而揭示中药复方治疗疾病的复杂关系[31]，对预测中药复方治疗的潜在疾病、阐述疗效机制具有重要意义。

古方一贯煎主要用于治疗各种疾病出现胸脘胁痛，吞酸吐苦，咽干口燥，舌红少津等症状的肝肾阴虚之证，这是中医临床“异病同治”的依据。我们通过构建中药成分-靶点-疾病网络，进行了一贯煎“异病同治”网络药理学的分析，预测出一贯煎可能治疗的疾病有癌症、精神分裂症、心血管疾病、焦虑症、炎症、抑郁症、肝纤维化、肝硬化、卵巢早衰等。其中，一贯煎与癌症、精神系统疾病、心血管系统疾病以及各种炎症相关性较大。在癌症中，乳腺癌、胰腺癌、肺癌节点度较高。这些大多被现代临床和实验研究所证实，能够治疗或缓解很多疾病或症状。其中，一贯煎治疗乳腺癌更年期患者三个月后，潮热盗汗、烦躁、抑郁等症状较治疗前显著减轻[19]。张等[24]发现一贯煎能明显改善非小细胞肺癌NP方案化疗后的肝肾功能和生活质量。治疗伴焦虑抑郁症状的2型糖尿病两个疗程后，能显著改善血糖水平和抑郁焦虑自评分[25]。治疗帕金森综合征三个月后治疗组的Webster和UPDERS评分较对照组低，且有统计学差异[27]。

表3 显著富集的15条GO生物学过程和KEGG通路

在实验研究方面，通过对大鼠肝脏组织的胶原面积评比判定肝纤维化程度，发现与模型组相比一贯煎能够显著改善大鼠肝纤维化程度（P＜0.05）[32]。谢等[33]发现一贯煎能够显著提高H22荷瘤小鼠肝癌的抑瘤率并明显减少血管内皮生长因子（VEGF）蛋白表达（P＜0.05）。研究还显示一贯煎能明显改善肝肾阴虚绝经前后的焦虑症状[34]。而且，通过测定大鼠血清III型前胶原（PCIII）、透明质酸酶（HA）、层粘连蛋白（LN）、IV型胶原（CIV）等肝纤维化指标发现一贯煎具有减轻肝组织病理损害、延缓肝纤维化进展[35]，并通过提高肝脏生物转化功能、抑制肝脏炎症反应、抑制肝细胞凋亡和肝星状细胞活化、抑制肝窦内皮损伤、改善肝脏糖代谢及水钠潴留等多种途径，抑制CCl4诱导大鼠肝硬化形成[36]，还能够提高2型糖尿病患者自我效能并降低胰岛素抵抗[37]。另外，一贯煎可以显著提高卵巢早衰大鼠血清中E2、ββ中衰水平，降低卵泡刺激素（FSH）水平（P均＜0.05），从而治疗卵巢早衰[38]。

本研究通过对一贯煎的网络药理学预测，获得了6个活性成分（松柏苷、阿托品、黄豆黄素、β胡萝卜素、谷甾醇以及豆甾醇），为进一步探讨这些天然化合物“异病同治”的效应提供了线索。而且，通过预测的活性成分和药物靶点，从GO生物学过程和KEGG通路两方面，进一步分析了一贯煎“异病同治”的机制。富集的生物学过程有药物应答、RNA聚合酶II启动子、转录的正调控、DNA模板、缺氧的细胞应答等。富集的通路有癌症通路、乙型肝炎通路、肿瘤坏死因子信号通路等，提示了一贯煎“异病同治”的机制可能通过调控癌症通路、乙型肝炎通路、肿瘤坏死因子信号通路以及缺氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路等影响肝肾阴虚证型的癌症、精神疾病、心血管疾病和炎症性疾病等的生物学过程。而且，前期研究报道一贯煎抑制CCl4诱导大鼠肝细胞凋亡[36,39]，也证实了一贯煎能够负调控凋亡过程的预测。

另外，还有关于一贯煎可以用于治疗干燥综合征皮肤病[40]、高血压[41]、高脂血症[42]以及妇科疾病[26,34,42,43]等的研究报道，但这些研究结果未在本次预测研究中体现出来，提示使用现有数据库进行网络药理学预测的局限性。

4 结论

对一贯煎“异病同治”的网络药理学分析有助于识别其有效活性成分及作用靶点，解释作用机制，为发现新的临床适应病症提供可能。但是，由于药物成分、靶点、疾病数据库的不完善，以及方药剂量研究缺乏导致的以生物利用度和类药性指数筛选活性成分的方法无法将化学成分在药材中的含量考虑在内，中药网络药理学的应用仍有不少缺陷，这些都需要我们不断完善，并进行后续临床试验及实验验证。

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