基于抗炎和氧化应激角度研究黄连解毒汤对动脉粥样硬化大鼠作用机制＊

余兰彬，陈 雨，徐国良，杨 乐，胡家丽，段江南，姜 丽＊＊

（1.江西中医药大学江西省中医病因生物学重点实验室 南昌 330004；2.江西省上饶市人民医院彩超科 上饶 334000）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是导致缺血性心脏病和中风的主要因素，可导致严重的心脑血管事件[1]，也是人类发病率最高、危害最大的疾病之一，且随着我国经济水平的提高和人口老龄化的快速增长，发病率持续上升。研究表明[2-4]，血中低密度脂蛋白（LDL）或氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL）增高、自由基（通常是由吸烟引起的）、高血糖及传染性病原体（如肺炎衣原体、牙龈卟啉菌和疱疹病毒等）都被认为与AS的发病相关。

Ross教授[5]提出的炎症损伤反应和氧化应激与AS的发病关系密切，在AS发生和发展中发挥了重要作用。氧化应激可加速低密度脂蛋白（LDL）在动脉内膜的沉积，使LDL成为氧化型LDL(ox-LDL），诱导单核细胞黏附、迁移进入动脉内膜，转化成巨噬细胞。故氧化应激可通过多方面参与AS的发生与发展[6]。因此，抗炎和抗氧化方面的用药成为这类疾病治疗的新方向，为预防和治疗AS及其相关性疾病的发生发展提供了新的思路与途径。

本实验从调节Ox-LDL、MCP-1、VCAM-1等炎症指标及抗氧化作用入手，探讨了黄连解毒汤干预治疗AS的可能作用机制。

1 材料

1.1 动物

清洁级雄性SD大鼠，（体重200±20 g，合格证号SCXK(京)2006-0009，购自斯莱克景达实验动物有限公司（湖南长沙）。饲养环境为排气通风笼具内（EVC），保持室温(22±2)℃，相对湿度（50±10）%。昼夜自然明暗交替，自由饮水，根据各组给予普通饲料和高脂饲料。

1.2 仪器

旋转蒸发仪（瑞士Buchi公司）；全自动酶标检测仪（北京中诺远东科技有限公司）；HH-W600三用恒温水箱（金坛市万华实验仪器厂）；KQ-300VDE型双频数控超声清洗器（昆山市超声仪器厂）；病理切片机（德国Leica RM 2016轮转式切片机）、切片刀（日本羽毛R35一次性刀片）、组织摊烤片机（武汉俊杰JK-6生物组织摊烤片机）、载玻片及盖玻片（江苏世泰实验器材有限公司）、显微镜（尼康E100型生物显微镜）、数码单反相机（佳能550D）。

1.3 试药与试剂

黄连（批号150507）、黄芩（批号150814）、黄柏（批号150130）、栀子（批号141210），上述药材均购自江西江中中药饮片有限公司；洛伐他丁（批号150501，购自江苏大洋制药有限公司）；高脂饲料和普通饲料（许可证号：SCXK（湘）2011-0003，购自北京科奥协力饲料有限公司）；维生素D3注射液（批号130140，购自上海通用药业股份有限公司）；丙二醇检测试剂盒、超氧化物气化酶检测试剂盒（许可证号：赣食药监械生产许20110023号，南京建成生物科技有限公司）、Ox-LDL、MCP-1及VCAM-1试剂盒（均购于武汉伊艾博科技有限公司）、包埋石蜡（国药集团，批号69019361）、苏木素（Sigma，批号H9627）、伊红Y(水溶性)（国药集团，批号71014544）、盐酸（国药集团，批号10011018）、二甲苯（国药集团，批号10023418）、中性树胶（国药集团，批号10004160）。

2 方法

2.1 黄连解毒汤水煎剂的制备

参照文献[7]，黄连、黄芩、黄柏、栀子按照原方配比3∶2∶2∶3，加6倍蒸馏水浸泡60 min。将浸泡后药材用大火煮沸后改为文火煎煮30 min，过滤药液，药渣再加4倍水用文火煎煮20 min。将两次药液合并，用旋转蒸发仪将药液浓缩至0.5 g/生药mL，得黄连解毒汤水煎剂，冷却后分装于4°C冰箱保存。

2.2 大鼠动脉粥样硬化模型的建立

参照文献[8,9]稍作修改，除空白对照组给予普通饲料外，模型组及给药组均给予高脂饲料，共饲养8周。饲料配方为（0.2%丙基硫氧嘧啶、0.5%胆酸钠、3%胆固醇、5%白糖、10%猪油、81.3%基础饲料）。高脂饲料组大鼠在第一周的第3天，按60万lU/Kg体重腹腔注射维生素D3，并于第2、4、6周的第3天，按20万lU/Kg体重腹腔注射维生素D3。8周后取血及各组织样本。

2.3 给药方案

各组大鼠分别为正常对照组（A）、模型对照组（B）、阳性药洛伐他汀组（C）、黄连解毒汤低、中、高剂量组（D、E、F）。从第3周开始，正常对照组和模型对照组分别灌胃等体积的生理盐水，每天1次，直至造模结束。阳性对照组按5 mg·kg-1灌胃洛伐他汀，每天1次，直至造模结束；黄连解毒汤低、中、高剂量组等体积分别按1.5、3、6 g生药/kg体重灌胃黄连解毒汤，每天1次，直至造模结束。

2.4 检测项目和检测方法

2.4.1 病理取材和染色

大鼠在末次给药30 min后，用10%水合氯醛（4.5 mL·kg-1剂量）腹腔注射麻醉，固定于大鼠操作板上，剪开腹腔，用肝素钠浸润过的注射器于腹主动脉内取血后，小心剪下各组腹主动脉，切取4 μm厚切片，经脱蜡、浸水、染色和固封等步骤，作常规HE染色。取大鼠肝脏，匀浆后置-80℃冰箱保存。

2.4.2 指标检测

大鼠肝匀浆中Ox-LDL、MCP-1、VCAM-1含量测定采用酶联免疫法（ELISA法），MDA、SOD含量采用光度法测定，根据各指标试剂盒提供的试剂与实验步骤进行操作，均采用全自动酶标检测仪完成测定。

2.5 数据处理

各组炎症及氧化相关指标数据采用Graphpad Prism软件（version 6.0）进行处理及作图。数据以平均值±标准差（±s）表示，各组数据的对比分析采用T检验，p≤0.05有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 黄连解毒汤对动脉粥样硬化大鼠腹主动脉病理学的改善作用

由图1可知，正常组：血管壁结构清晰完整，平滑肌细胞排列整齐紧致，内膜光滑，无增生；模型组：血管结构异常，内膜增厚，表面粗糙，有多数的隆起，平滑肌细胞排列紊乱疏松，有斑块的形成；阳性对照组：血管内膜基本无增厚，且较平滑，其平滑肌细胞排列较整齐架构清晰，泡沫细胞少；HJD低剂量组：血管内膜粗糙，褶皱程度与B组相比较轻，管壁增厚，平滑肌细胞有一定程度上的紊乱，较疏松，且有较大的凸起，总体较模型组平滑；HJD中剂量组：血管内壁平滑肌细胞排列较整齐致密，内膜无大幅度的起伏凹凸，内膜增厚较少；HJD高剂量组：平滑肌致密整齐，内膜光滑，局部见少量粗糙，有少量泡沫细胞，血管增厚较少。结果表明，洛伐他丁及HJD各剂量均能够明显改善AS的程度。

3.2 黄连解毒汤对动脉粥样硬化大鼠肝匀浆Ox-LDL、MCP-1、VCAM-1表达的影响

由表1可知，与正常组比较，模型组MCP-1、Ox-LDL和VCAM-1含量均显著升高；给药后，阳性对照组和HJD低、中剂量组MCP-1、Ox-LDL和VCAM-1含量显著下降；高剂量组MCP-1和VCAM-1含量显著下降。

3.3 黄连解毒汤对动脉粥样硬化大鼠肝匀浆MDA及SOD表达的影响

与正常对照组比较，造模后，SOD含量显著下降，MDA含量显著上升，给药后，阳性组和HJD高剂量组SOD显著上升（p＜0.05）；阳性组和HJD各剂量组MDA含量均显著下降（p＜0.05）。结果见表2。

4 讨论

中医认为气滞血瘀，脉失通利，则易于粥样斑块的形成[10]。湿热之邪（无论是外感湿热或是内伤杂病湿热）长期蕴结不解亦可化为毒，致气血运行失畅，瘀血内生，最终都可能导致AS，进而引发一系列心脑血管疾病如高血压、冠心病、脑中风等并发症。故清热解毒燥湿法对防治AS尤为关键。

AS病变过程中单核巨噬细胞系统起着重要的作用。体内单核/巨噬细胞系统被激活后会释放大量的炎症因子，导致动脉内膜形态的异常及功能的紊乱，如脂质沉积于内膜下，造成血管组织严重受损。因此，单核细胞黏附并趋化迁入血管内膜是AS形成的早期事件[11]。而MCP-1是趋化单核细胞和淋巴细胞迁入血管内膜的主要细胞因子，可诱导单核细胞、血管内皮细胞等表达黏附分子，使各种炎性细胞向病变部位聚集，不断进入斑块组织中，诱发单核细胞和淋巴细胞对炎症因子的刺激做出应答，促使免疫损伤不断加重，粥样斑块不断形成。由此，MCP-1被认为是潜在的可反映AS早期改变与预后的生化指标[12,13]。VCAM-1在内皮细胞、上皮细胞及巨噬细胞等细胞上表达，受到炎症因子等刺激后，其表达水平明显上升[14]。另有研究表明[15,16]，清热解毒活血复方不仅能减少非致炎状态下血管内皮细胞和中性粒细胞的黏附，还能减少致炎因子所诱导的这两类细胞黏附作用的增强，从而稳定粥样斑块，防止破裂，对动脉形态学和功能学的改变有保护作用。

图1 HJD对动脉粥样硬化大鼠腹主动脉病理学改善情况（×200）

表1 HJD对肝匀浆MCP-1、Ox-LDL和VCAM-1含量的影响(±s,n=6)

表1 HJD对肝匀浆MCP-1、Ox-LDL和VCAM-1含量的影响(±s,n=6)

注：与模型组（B组）比较，*p＜0.05，**p＜0.01。

VCAM-1水平118.07±3.49**166.34±14.47 115.51±15.39**136.25±12.7**120.47±14.57**107.26±6.32**组别正常对照组模型对照组阳性对照组HLJDT低剂量组HLJDT中剂量组HLJDT高剂量组MCP-1水平19.54±2.32**40.76±5.66 24.58±3.39**27.63±3.55**26.06±1.89**21.59±2.18**Ox-LDL水平28.72±3.71**36.53±2.59 29.29±4.75*32.07±3.58*31.08±4.65*33.71±5.45

表2 HJD对肝匀浆MDA、SOD含量的影响(±s,n=6)

表2 HJD对肝匀浆MDA、SOD含量的影响(±s,n=6)

注：与模型组（B组）比较，*p＜0.05，**p＜0.01。

肝匀浆MDA水平15.09±1.56**23.47±4.52 16.05±1.94**17.5±1.48*17.94±1.6*15.74±1.08**组别正常对照组模型对照组阳性对照组HLJDT低剂量组HLJDT中剂量组HLJDT高剂量组肝匀浆SOD水平192.11±1.49**186.22±2.18 192.99±2.21**183.2±6.87 191.05±9.13 193.15±5.19*

黄连解毒汤由黄连、黄柏、黄芩和栀子四种药组成，是清热燥湿解毒的经典名方。研究表明，本方可下调炎性细胞因子的表达[17]，并通过抵抗肺炎衣原体（Cpn）感染炎症过度反应而发挥抑制AS进程的作用[18]。此外，氧化应激及其介导的脂质过氧化反应在AS的发生发展中起到重要作用。氧自由基与脂肪酸发生链式反应产生的脂质过氧化产物如MDA，能刺激血管平滑肌细胞的增殖，从而间接地反出细胞损伤的程度[19]。本实验中，黄连解毒汤组MCP-1，VCAM-1表达明显降低，提示黄连解毒汤可以抑制AS大鼠炎症反应，从而干预AS斑块的形成。有文献报道[20，21]，其抑制黏附因子的表达可能是其消退AS斑块的重要机制。阳性药洛伐他丁及黄连解毒汤组均能通过提高SOD活性，显著降低MDA和ox-LDL的生成，显著地降低高脂刺激所致的AS形成过程中氧化应激反应。

黄连解毒汤作为清热解毒燥湿的良方，能够提高机体抗氧化能力，减少MDA的对动脉的损伤，防止各处动脉炎性因子和氧化损伤的侵害。本研究基于中医清热解毒燥湿防治AS角度，从抗炎抗氧化等指标入手，初步阐明黄连解毒汤抗AS的作用机制，但其更深入的机制还有待进一步研究。

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