食管鳞状细胞癌高分辨率显微内镜图像定量分析的诊断价值

贾逸文，屈亚威，刘海峰，

食管鳞状细胞癌高分辨率显微内镜图像定量分析的诊断价值

贾逸文1，屈亚威2，刘海峰1，2

目的 探究食管鳞状细胞癌高分辨率显微内镜图像定量分析的诊断价值。方法 选择35例食管鳞状细胞癌和正常食管黏膜的大体标本，在前期制定的食管鳞状细胞癌高分辨率显微内镜(high resolution microendoscopy，HRME)诊断标准的基础上，回顾性分析其HRME图像特征。根据标本病理结果，由一名经验丰富的HRME医师挑选出1张HRME图片，纳入训练集，用计算机软件对图像特征进行定量分析，制定图像分析诊断标准。在此基础上，将100例内镜下疑诊食管鳞状细胞癌的活检标本的HRME图像纳入测试集，进行HRME图像定量分析，将计算机分析得出的预诊断结果与病理结果进行比较，评估定量分析HRME图像对食管鳞状细胞癌的诊断价值。结果 通过定量分析HRME图像中细胞的核面积(nuclear area，NA)对食管鳞状细胞癌和正常食管黏膜进行区分，经统计学分析，在训练集中的敏感性和特异性分别为90%和97%，测试集中的敏感性和特异性分别为97%和90%。结论 定量分析HRME图像可以区分食管鳞状细胞癌组织和正常食管黏膜，并能够增加诊断的客观性，有利于HRME技术的推广应用。

高分辨率显微内镜；食管癌；定量分析；诊断

食管癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其术后的5年生存率仅为19%[1]。而鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是我国最常见的病理类型。目前，国际上公认诊断食管癌的方法是卢戈碘染色后对食管不染色区域进行病理活检[2]。这种方法虽然敏感性超过了95%，但是特异性低于65%[3，4]，很多食管表面的炎性病变常常也表现为不染或淡染区域，为了不造成漏诊，临床采取多部位活检的方法，不仅增加了患者的费用，也延长了检查时间，造成大量临床资源的浪费[5-7]。近年来，随着共聚焦显微内镜(confocal laser endomicroscopy，CLE)、高分辨率显微内镜(high-resolution microendoscopy，HRME)等亚细胞显微成像技术的不断出现[8-12]，能够在内镜检查的同时，对病变区域实现类似于病理活检的成像检查，提高了食管癌的诊断效率，对改善预后具有十分重要的意义。

本课题组研发了一套HRME成像设备，在前期研究中，利用HRME技术已对食管鳞状上皮炎性反应、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变、食管鳞状细胞癌等标本进行成像，并总结出相关的诊断标准。虽然初学者通过学习诊断标准可以掌握HRME诊断技术[13，14]，但是不同的观察者受到自身的主观影响，对同一病变的HRME图像诊断时存在差异，影响其诊断的准确性。然而，通过对HRME图像进行计算机图像处理并定量分析，不仅能够增加HRME诊断的客观性，同时减少了诊断时间[15-17]。本研究在之前制定的食管鳞状细胞癌诊断标准的基础上[18]，通过定量分析HRME图像，从而评估这种方法对食管鳞状细胞癌的诊断价值。

1 材料与方法

1.1 材料 选择2015-05至2016-05就诊于武警总医院胸外科并行食管鳞状细胞癌切除手术的大体标本35例，以及2015-05至2016-05就诊于武警总医院消化内镜中心行内镜检查时疑诊为食管鳞状细胞癌的活检标本100例。所有患者均签署知情同意书。

1.2 试剂与药品 0.9%氯化钠注射液(辰欣药业股份有限公司)、0.01%原黄素盐酸盐(美国Sigma公司)、链霉蛋白酶颗粒(北京泰德制药股份有限公司)、碳酸氢钠(北京泰德制药股份有限公司)等。

1.3 成像设备 自主研发的HRME成像系统，包括白光LED光源、500 nm二向色镜、滤光片、1.8 m含30000像元的传像光纤、10×显微物镜、三维组合平移台、科学级低温制冷CCD相机和计算机图像处理软件，成像过程中HRME以15帧/s的速度摄取图像，由CCD传输至计算机。

1.4 方法

1.4.1 HRME检查 在大体标本中，选择肿瘤组织及切缘附近的正常食管表面黏膜组织的标本。对于内镜下疑诊为食管鳞状细胞癌的患者，常规行组织活检，选择组织较完整、表面残渣少的活检标本。大体标本和活检标本依次使用生理盐水，去黏液剂(链霉蛋白酶颗粒和碳酸氢钠混合溶液)和生理盐水进行冲洗，去除表面黏液和残留物，干棉球擦干，备用。将标本展平置于成像平台上，局部喷洒0.01%原黄素盐酸盐2.0～3.0 ml，染色30 s后用生理盐水洗去组织表面残留染料，干棉球擦干组织表面的液体。光纤头端以不同角度观察组织表面，留取清晰的图片用于图像分析。

1.4.2 病理检查 HRME成像后，进行点对点活检，标本经甲醛溶液固定，行病理学检查。

1.4.3 图像质量 控制所有拍摄的HRME图像由1名经验丰富的HRME医师根据病理结果进行图片筛选，留取病理提示为食管鳞状细胞癌和正常鳞状上皮的HRME图像。去除有运动伪影的、离焦的、有杂质覆盖及病理诊断为其他的HRME图像，从剩余图像中选取一张能最能体现病变特征的清晰HRME图像。所有大体标本摄得的HRME图像纳入训练集，所有活检标本摄得的图像纳入测试集。

1.4.4 图像分析 在训练集中，分别提取食管鳞状细胞癌组和正常鳞状上皮HRME图像特征进行分析。首先在图像中去除过暗和过亮的区域，这些区域是由于成像光纤头端不平整或染料聚集造成的。通过对图像进行低通滤波处理，使用阈值标记出过暗或过亮的区域，将这些区域去除，留下亮度均匀的区域中，选取500×500像素大小区域作为可疑病灶区域(region of interest，ROI)进行图像分析。对ROI区域进行高斯滤波处理，去除图像中的网格，这些网格是光纤束的轮廓，在成像时不可避免，会影响图像质量。形态学图像处理标记并分割出ROI中的细胞核。使用直方图二值化的算法，确定细胞核的阈值，可以将ROI中的细胞核和核外胞质进行分割，并计算细胞核面积。整个图像分析过程耗时2.5 s(图1)。

1.4.5 图像分类 分别计算在训练集中食管鳞状细胞癌和正常鳞状上皮HRME图像ROI中的核面积大小，寻找区分病变的最适值。将此值带入测试集加以验证，以病理学为金标准，评估定量分析HRME图像对食管鳞状细胞癌的诊断价值。

1.5 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行数据分析。分别计算在训练集、测试集中定量分析HRME图像对食管鳞状细胞癌诊断的敏感性、特异性，绘制ROC曲线，计算AUC面积。

图1 高分辨率显微内镜图像诊断食管鳞状细胞癌图像定量分析流程

A，F.选取可疑病灶区域；B，G.光纤轮廓形成图像中的网格；C，H.使用高斯滤波去除图像网格；D，I.直方图二值化分割细胞核；E，J.计算细胞核面积

2 结 果

2.1 一般情况 在35例大体标本中，包括溃疡型9例，肿块型19例和缩窄型7例，病理检查后，诊断为中-高分化鳞癌10例，中分化鳞癌15例和中-低分化鳞癌9例，HRME成像的正常食道黏膜经病理检查后均证实为正常鳞状上皮组织。100例活检标本中，病理检查后，诊断为正常组织58例，食管鳞状细胞癌20例，其他22例。

2.2 HRME 图片选择35例大体标本共获得756张图片，经筛查后留取60张图片并纳入训练集用于图像分析，制定最适细胞核面积。100例活检标本共获得1283张图片，经筛查后，留取78张图片纳入测试集用于图像分析，评估最适细胞核面积的诊断效果。135例拍摄位点及病理结果见表1。

表1 135例HRME拍摄位点病理结果 (n)

2.3 定量图像分析效果 在训练集中，所用图像将按照图像分析步骤被定量分析，计算细胞核面积并记录。在正常鳞状上皮细胞图像中，细胞排列规则，细胞核圆，大小均一，核间距正常，视野内的细胞形态基本一致；鳞状细胞癌图像中，细胞排列紊乱，细胞核大小不一，形态各异，排列及其紊乱，核间距减小，同时出现了大量的细胞核叠加。经计算ROI区域中的细胞核面积，正常鳞状上皮细胞的平均核面积为(157.32±60.67)μm2，而鳞状细胞癌的平均核面积为(583.40±146.40)μm2，两组细胞核面积差异具有统计学意义(P<0.01)。

训练集中正常鳞状上皮及食管鳞状细胞癌细胞的核面积散点图，并用虚线表示出可以区别两种结构的最适核面积，最适核面积为381.25 μm2。将此处作为诊断指标，敏感性和特异性分别为90%和97%(图2A)。在测试集中应用得到的最适核面积进行验证，诊断正常鳞状上皮与食管鳞状细胞癌细胞的敏感性和特异性分别为97%和90%(图2B)。训练集和测试集的受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)中，ROC曲线下面积(area under curve，AUC)分别为0.99和0.98(图3)。

图2 高分辨率显微内镜拍摄位点的分布

图3 图像定量分析诊断效果

A.训练集，应用最适核面积诊断食管鳞状细胞癌敏感性和特异性分别为90%和97%；B.测试集，最适核面积诊断食管鳞状细胞癌敏感性和特异性分别为90%和97%；AUC为曲线下的面积

3 讨 论

HRME作为一种新型的内镜检查手段，可以对组织的亚细胞结构进行显微观察，具有广阔的应用前景[19-21]。本课题组前期研究证明，通过判读HRME检查图像可以诊断食管鳞状细胞癌，敏感性为96%，特异性为 86%[18]。作为一种新技术，熟练掌握并运用其诊断疾病，需要一定的学习时间[22]。由于不同学习者自身的素质不同，对病变的主观判断也存在差异[23]，而这种差异往往会影响诊断结果，造成漏诊误诊。通过定量分析HRME图像，可以提取其特征值，采用比较特征值的差异来诊断疾病，减少了人为因素的干扰，增加HRME诊断的客观性，从而提升了诊断准确性[24]。

本研究评估了定量分析HRME图像诊断食管鳞状细胞癌的可行性，证明通过计算并比较HRME图像中细胞核面积，可以区分食管正常鳞状上皮和食管鳞状细胞癌。这种诊断方法在训练集中其敏感性为90%，特异性为97%，测试集中敏感性为97%，特异性为90%。相比之前通过人为判读HRME图像的诊断方法，不仅具有极高的敏感性和特异性，还避免了不同HRME医师的主观因素对诊断结果的干扰，增加了诊断的准确性。同时，计算机可以根据HRME图像自主进行预诊断，极大的减少了HRME医师的工作压力，方便非专业HRME医师使用，有助于HRME技术的推广。

食管鳞状上皮细胞内含有大量糖原，遇碘后发生化学显色反应呈棕褐色，而食管癌及癌前病变的细胞内糖原含量减少，遇碘不着色，形成不染区域。所以，目前临床上广泛使用的卢戈碘对食管可疑病变进行染色的方法来发现食管癌及癌前病变。碘染后能够清晰显示食管病变黏膜的范围及形态，在不染区域进行活检，能够提高活检的准确性及早期食管癌的检出率，据文献[3，4]报道，其诊断食管癌的敏感性超过95%，特异性低于65%。这种方法虽然对病变有极高的敏感性，但特异性并不高，加之活检具有的随意性，且病变分化程度具有不均一性，临床使用中往往因为不能准确活检到食管癌细胞，而造成漏诊。

与卢戈式碘染色活检法一样，HRME技术同样建立在检查者主观疑诊的基础上，所以仍然存在漏诊的情况。但如能将HRME技术与卢戈式碘染色活检相结合，利用卢戈碘染色的高敏感性发现病变，并在卢戈碘染色的基础上，对不染区域进行HRME检查，后再取活检可以弥补单纯碘染色特异性低的不足。能够从根本上提升活检的准确性。对于临床诊断食管鳞状细胞癌具有重要意义。

本研究结果表明，通过定量分析HRME图像对诊断食管鳞状细胞癌具有重要意义，但此研究仍有一些局限性：(1)本研究为单中心实验，未做多中心验证；(2)受到自动图像帧选和算法处理时间的限制，图像定量分析还未能做到实时分析。下一步准备在图像识别方面做新的研究。

综上所述，尽管该技术还未能达到理想的效果，但本实验展示了定量分析HRME图像对食管鳞状细胞癌具有较高的诊断价值，如能与当前染色活检法相辅相成，可以提高活检的准确性，并减少不必要的活检操作。同时，图像定量分析也有利于HRME技术的推广。未来实现在体实时的HRME图像定量分析，可对病变边界进行判断，这将有利于在治疗中减少病变的切除范围，从而减少治疗操作对患者造成的医疗创伤[25]。随着HRME技术的相关研究越来越多，这项新的技术也必将体现更好的诊断价值。

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(2016-10-17收稿 2016-12-06修回)

(责任编辑 武建虎)

Quantitative analysis of high resolution microendoscopic images for diagnosis of esophageal squamous cell carcinoma

JIA Yiwen1，QU Yawei2，and LIU Haifeng1，2.

1.Graduate School, Anhui Medical University，Hefei 230032，China; 2.Department of Gastroenterology，General Hospital of Chinese People’s Armed Police Force，Beijing 100039，China

Objective To explore the diagnostic value of high-resolution microendoscopy in quantitative analysis of esophageal squamous cell carcinoma.Methods Thirty-five cases of esophageal squamous cell carcinoma and normal esophageal mucosa were selected. The HRME image of esophageal squamous cell carcinoma was analyzed retrospectively. According to the pathological results of specimens, an HRME image was selected by an experienced HRME clinician to be included in the training set. The image features were quantitatively analyzed by computer software, and diagnostic criteria for image analysis were formulated. On this basis,the HRME images of biopsy specimens of 100 cases of suspected esophageal squamous cell carcinoma were input into the test set for quantitative analysis of these HRME images. The results of pre-diagnosis via a computer were compared with pathological results. The diagnostic value of quantitative HRME images for esophageal squamous cell carcinoma was determined.Results The quantitative analysis of the nuclear area in HRME images was used to distinguish esophageal squamous cell carcinoma from normal esophageal mucosa. Statistical analysis showed that the sensitivity and specificity were 90% and 97% respectively in the training set, but were 97% and 90% respectively in the test set.Conclusions Quantitative analysis of HRME images can distinguish esophageal squamous cell carcinoma from normal esophageal mucosa, increase the reliability of diagnosis, and contribute to the popularization and application of this technology.

high resolution microendoscopy；esophageal squamous cell carcinoma；quantitative analysis；diagnostic

首都临床特色应用研究(Z141107002514099)

贾逸文，硕士研究生。

1.230032 合肥，安徽医科大学研究生院;

2.100039 北京，武警总医院消化内科

刘海峰，E-mail：haifengliu333@163.com

R604；R735.1