PCR技术在复合调味料中沙门氏菌检测的应用

李 爽

（天津春发生物科技集团有限公司，天津 300300）

PCR技术在复合调味料中沙门氏菌检测的应用

李 爽

（天津春发生物科技集团有限公司，天津 300300）

根据沙门氏菌基因上的特有序列设计引物，对食品中沙门氏菌检验的国家标准中涂布平板后的疑似菌落进行菌液PCR反应，由此来检测沙门氏菌。该方法能有效地应用在复合调味料中沙门氏菌的定性检测，与传统的验证方法相比，该方法特异性强，灵敏度高，操作简单，更大程度地节约时间成本和人力成本。

复合调味料；沙门氏菌；特定序列；PCR检测

沙门氏菌是一种常见的致病菌，可以引起人的食源性疾病［1］，已严重威胁到人类健康，造成了巨大的经济损失［2］，同时它也是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一，在国内外报道的食物中毒中，由沙门氏菌引起的食物中毒占首位［3］。沙门氏菌病的病原体属肠杆菌科，革兰氏阴性肠道杆菌。已发现的近1000种（或菌株），按其抗原成分，可分为甲、乙、丙、丁、戊等基本菌组。其中与人体疾病有关的主要有甲组的副伤寒甲杆菌，乙组的副伤寒乙杆菌和鼠伤寒杆菌，丙组的副伤寒丙杆菌和猪霍乱杆菌，丁组的伤寒杆菌和肠炎杆菌等。沙门氏菌最适繁殖温度为37℃，在20℃以上即能大量繁殖。

2013年发布最新的食品安全国家标准（GB 29921－2013）规定，沙门氏菌在各类食品中的限量值均为0，任何食品中都不得检出沙门氏菌。在食品行业中检测沙门氏菌主要应用国家标准GB 4789.4－2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》［4］中规定的微生物检验法，该方法是目前世界各国普遍接受的标准方法。该方法总体可分为5个步骤：前增菌、选择性增菌、分离培养、生化鉴定及血清学鉴定，先对待检测物进行菌体培养，而后涂布平板，再根据平板上长出的疑似菌落进行一系列的验证试验。虽然该方法是迄今为止最确实的方法，但由于沙门氏菌血清型繁多，生化特性各异，检验程序复杂，耗时长，至少需要4～7天才可得到准确的检测结果。

随着分子生物学技术的不断应用和发展，聚合酶链式反应技术（PCR）逐渐应用于食品中沙门氏菌的检测，聚合酶链式反应（PCR）是一种体外酶促基因扩增技术，可在短时间内将靶DNA扩增数百万倍。用该方法检测食品中沙门氏菌，具有特异性强、灵敏度高及操作简便、快速等特点。因此，利用PCR技术可以建立一种快速检测复合调味料中沙门氏菌的方法：根据沙门氏菌的特定序列设计引物，将国标中涂布平板后的疑似菌落直接进行菌液PCR反应，由此来检测沙门氏菌。本文通过大量的实验验证，建立了复合调味料中沙门氏菌的PCR快速检测技术，并且运用到实际的工作中，从而缩短了对沙门氏菌的检测判定周期，同时提高了灵敏度，降低了时间和人力成本。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 液态复合调味料

鸡汁调味料。

1.1.2 沙门氏菌菌株

从动物粪便中分离获得。

1.1.3 引物的合成

根据沙门氏菌组氨酸转运操纵子基因上的一段特定序列［5，6］，设计合成一段引物，引物长度为25bp，扩增的目的片段长度为495bp，该引物由上海生物工程公司合成。

引物I：5＇-ACT GGC GTT ATC CCT TTC TCT GGT G；

引物II：5＇-ATG TTG TCC TGC CCC TGG TAA GAG A。

1.1.4 其他材料

Taq DNA聚合酶 天津谦泰生物技术有限公司；dNTP 宝生物工程有限公司；溴化乙锭、琼脂糖 上海生物工程公司。

1.1.5 实验设备

基因扩增仪（ABI9700） 美国应用生物系统公司；核酸电泳仪 北京六一仪器厂；凝胶成像仪 广州深华生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培养基配制

亚硫酸铋（BS）琼脂培养基：蛋白胨10g、牛肉膏5g、葡萄糖5g、硫酸亚铁0.3g、磷酸氢二钠4g、煌绿0.025g、柠檬酸铋铵2g、亚硫酸钠6g、琼脂20g、蒸馏水1000mL、pH 7.5±0.2。

木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂培养基：酵母膏3g、L-赖氨酸5g、木糖3.75g、乳糖7.5g、蔗糖7.5g、去氧胆酸钠2.5g、柠檬酸铁铵0.8g、硫代硫酸钠6.8g、氯化钠5g、琼脂15g、酚红0.08g、蒸馏水1000mL、pH 7.4±0.2。

1.2.2 样品筛选

将鸡汁调味料按照食品安全国家标准GB 4789.4－2010的检测方法进行沙门氏菌检测，发现无可疑菌落，判定该样品不含沙门氏菌，可用于实验。

1.2.3 单菌落制备

取少量沙门氏菌菌液混合到鸡汁调味料中，混合后分别用接种环取液，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板上。在（36±1）℃条件下在BS平板上培养40～48h，在XLD琼脂平板上培养18～24h（每个平板做3个平行实验）。

将不含沙门氏菌的鸡汁调味料分别用接种环取液，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板上。按照上述同样的方法进行培养。

培养结束后取出平板，根据国家标准GB 4789.4－2010给出的疑似沙门氏菌在平板上的判定方法（见表1）观察疑似沙门氏菌菌落数，结果见表2。

表1 疑似沙门氏菌在BS和XLD平板上的判定标准

表2 含有沙门氏菌的平板涂布结果

不含沙门氏菌液体的鸡汁调味料直接涂布的BS平板和XLD平板上未出现疑似菌落。

1.2.4 PCR检测

对所有疑似沙门氏菌的菌落直接挑取单菌落进行PCR检测（以无菌水为模板做空白对照）。

PCR反应体系：在50μL反应体系中，10XPCR反应缓冲液（含Mg2＋）5μL，dNTP（2.5mmol/L）4μL，用灭菌牙签沾取平板上的单菌落置于PCR反应管中作为模板，引物P1，P2各2μL，Taq DNA聚合酶0.25～0.5μL，无菌水加至50μL。

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s；56℃退火1min；72℃延伸1min，经过30个循环；最后72℃保温5min。

核酸电泳条件：配制浓度为1.5%的琼脂糖溶液，0.5mg/L，加入溴化乙锭（EB）制作凝胶，在恒压100V条件下电泳25min，而后取出凝胶在凝胶成像仪中观察结果。

2 结果

对PCR产物的核酸电泳结果显示：挑取疑似菌落116个，其中113个能扩增出目的条带且条带大小在500bp附近，空白对照无目的条带产生，随即对这116个疑似菌落进行生化试验验证，验证的结果显示与PCR检测结果一致（图1为检测结果的部分电泳图），116个疑似菌落中有113个是沙门氏菌；另外3个不属于沙门氏菌，因此本方法可以直接用于液态复合调味品的沙门氏菌检测，而且可以节省大量时间。

图1 平板中疑似沙门氏菌的菌落PCR检测电泳图

3 讨论

目前食品检测中，沙门氏菌的检测方法是涂布平板后对疑似菌落进行生化反应鉴定和血清学鉴定，方法繁琐，实验量大，耗时耗力。而PCR方法检测沙门氏菌只需将疑似菌落直接进行PCR鉴定即可得出结果。该检测方法特异性好、速度快、省时省力，能把国标检测沙门氏菌需要的4～7天缩短到2天。

在实际的工作中，检测液态复合调味料时应该先按照国标的方法对调味品中的菌体进行增菌，而后涂布BS和XLD平板挑取疑似菌落，该检测方法也可以用于半固态或固态的复合调味料中沙门氏菌的检测，只需将半固态或固态的复合调味料用无菌水稀释溶解后进行增菌培养，再涂布相应的平板培养即可，后续的PCR检测基本和上述方法一致。该方法也可延伸到对复合调味料中其他致病菌的定性检测，只需设计出针对该致病菌的特定核酸序列，而后优化进行疑似菌体的PCR程序即可。

［1］郭胜利.136起食物中毒统计分析［J］.海峡预防医学杂志，1999（1）：32.

［2］武和平.不容忽视的沙门氏菌［J］.国外畜牧科技，1992，19（2）：50-51.

［3］孟昭赫.食品卫生检验方法注解（微生物学部分）［M］.北京：人民卫生出版社，1990：365.

［4］GB 4789.4－2010，食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验［S］.

［5］Cohen N D，Wallis D E，Neibergs H L，et a1.Comparison of the polymerase chain reaction using genus-specific oligonucleotide primers and microbiologic culture for the detection ofSalmonellain drag-swabs from poultry houses［J］.Poultry Science，1994，73（8）：1276-1281.

［6］Cohen N D，Megruder E D，Neibergs H L，et a1.Detection ofSalmonellaenteritidisin feces from poultry using booster polymerage chain reaction and oligonucleotide primers specific for allmembers of the genusSalmonella［J］.Poultry Science，1994，73：354-357.

The Application of PCR Technology forSalmonellaDetection in Compound Seasoning

LI Shuang
（Tianjin Chunfa Bio-Technology Group Co.，Ltd.，Tianjin 300300，China）

According to the characteristics on theSalmonellagene sequence design primers，the PCR reaction is used for suspected bacterial colonies after being coated in the national standard ofSalmonelladetection in food，use this method to detectSalmonella.This method can be effectively applied in compound seasoning for qualitative detection ofSalmonella，compared with the traditional verification method；this method has strong specificity，high sensitivity and simple operation，it saves more time and manpower costs.

compound seasoning；Salmonella；specific sequence；PCR detection

TS264.9

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.03.033

1000-9973（2017）03-0138-03

2016－09－12

李爽（1984－），女，助理工程师，主要从事食品微生物检测方面的研究。