黄浆水发酵生产SCP的菌种选配

车颖洁，郝林

（山西农业大学食品科学与工程学院，山西晋中 030801）

黄浆水发酵生产SCP的菌种选配

车颖洁，郝林

（山西农业大学食品科学与工程学院，山西晋中 030801）

以黄浆水为原料，采用液态发酵方式，选配适合其发酵生产单细胞蛋白（SCP）的菌种，进行单因素及正交试验。结果表明：扣囊拟内孢霉（EndomycopsisfiburigerCICC31258）、解脂假丝酵母（Candida lipolyticaCICC32457）、产朊假丝酵母（CandidautilisCICC31268）、白地霉（Geotrichumcandidum linkSH501）是适合发酵黄浆水生产单细胞蛋白的优良菌种；菌种间的最佳发酵配比为白地霉（SH501）∶扣囊拟内孢霉（CICC31258）∶解脂假丝酵母（CICC32457）∶产朊假丝酵母（CICC31268）为2∶1∶1∶2或者3∶1∶1∶2。

大豆黄浆水；单细胞蛋白（SCP）；菌种配比

豆制品营养丰富，风味独特，深受人民群众的喜爱。据统计，2010年我国豆制品的投豆量达到9.753×105吨，国内豆制品生产企业每年黄浆水排放量达到300万吨以上［1］。在豆腐压榨到成型过程中，为了使豆腐获得特定的含水量、弹性特征等，施加一定的压力把多余的水分排出，使豆浆中的蛋白凝固成豆腐，分离出来的即压滤废水，又称黄浆水［2］。经过对黄浆水进行检测得知，其主要成分有维生素、矿物质、糖类、蛋白质、脂类、氨基酸、可溶性固形物等，其中BOD高达7400mg/L，COD高达10000mg/L，总氮（TN）和氨氮（NH3-N）也较高，属于高浓度可生化性程度高的废水。目前企业都采取生化处理方式，投资大且效率低［3，4］。黄浆水的资源化利用符合我国“建设资源节约型、环境友好型社会、大力发展循环经济”的重要导向。

单细胞蛋白（SCP）是利用各种基质培养细菌、酵母菌、真菌、藻类等获得的微生物蛋白，又称为菌体蛋白。其本质是由蛋白质、碳水化合物、脂肪、核酸、维生素、无机物等组成的细胞质团。近年来成为关注的热点，在饲料中SCP被作为一种重要的蛋白质增补剂来代替常规蛋白质［5，6］。Gao Yurong等利用热带假丝酵母在pH 5.5，30℃时发酵大豆蛋白废水生产单细胞蛋白，蛋白量达到6.11g/L。张建斌等［7］在以甘蔗糖蜜作为发酵基质生产酵母单细胞蛋白的菌种选育中，经过摇瓶培养，筛选得到了一株总蛋白得率较高的啤酒酵母S9。德国慕尼黑餐厅出售的一种既像牛排又像猪脯的“神奇牛排”，实际上就是SCP。欧洲最大的人造肉食品公司Marlow生产的Quorn是当今唯一面向人类的SCP产品。在国外，已经开展了把SCP掺入饼干、点心等食品中以提高营养价值的试验，但仍处于研究开发阶段［8，9］。

本文从能够有效利用黄浆水中营养成分且安全性好的工业菌种中选取扣囊拟内孢霉酵母（Endomycopsis fiburigerCICC 31258）、解脂假丝酵母（CandidalipolyticaCICC 32457）、产朊假丝酵母（CandidautilisCICC 31268）、白地霉（GeotrichumcandidumlinkSH501）4类菌种作为发酵黄浆水生产SCP的菌群［10－12］，进行了单菌种试验及多菌种的正交试验，以此来选择出最佳的菌种配比，并对黄浆水的发酵工艺进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种与原料

扣囊拟内孢霉（CICC31258）、产朊假丝酵母（CICC31268）、解脂假丝酵母（CICC32457），购于中国食品发酵工业研究院；白地霉（SH501），山西农业大学食品院微生物实验室保藏菌种。大豆黄浆水：取自豆制品加工企业。

1.1.2 培养基

麦芽糖培养基：蛋白胨10g、麦芽糖20g、酵母膏5g、琼脂15g、水1000mL，自然pH，在0.1MPa，121℃下灭菌20min。

马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000mL，煮沸30min，双层纱布过滤，滤液中加2%葡萄糖，补充水分，加2%琼脂，自然pH，在0.075MPa，115℃下灭菌30min。

1.2 仪器与设备

恒温培养振荡器 上海智诚分析仪器制造有限公司；台式离心机 上海安亭科学仪器厂；BL-58A灭菌锅 上海博迅实业有限公司；水平型超净工作台 上海力申科学仪器有限公司；电热恒温培养箱 北京市光明医疗仪器厂；电热恒温鼓风干燥箱 北京医疗设备厂。

1.3 方法及步骤

1.3.1 生长曲线的制作

分别将已选取的菌株进行活化，取活化好的菌种1环接入已配制好的100mL相应液体培养基中，在30℃，140r/min的恒温培养振荡器中培养12h后转接100μL于另一新的100mL液体培养基中，继续振荡培养12h后即为种子液。

分别对4株菌种进行60h的培养测定，每2h进行测定1次，记录数据，以便获得其生长曲线，为选择对数期的菌种提供依据［13］。

1.3.2 种子液的制备

取1环经过斜面培养基活化好的菌体接种到相应的已灭菌的100mL液体培养基中，在140r/min，30℃的恒温培养振荡器中培养至对数期时分别取100μL接入到新的100mL液体培养基中，继续培养至对数期后即为种子液。

1.3.3 正交试验

在进行菌株配比试验时，首先进行单菌种发酵试验，分别将4株菌的种子液在对数中期接入经过灭菌（115℃，0.075MPa，5min）冷却后的100mL黄浆水中，用8层纱布封口，在恒温培养振荡器中于28℃，140r/min条件下培养24h，利用台式离心机进行离心（4000r/min，20min）分离，然后在70℃烘箱中烘干至恒重，称重［14，15］。

在单个菌种发酵试验的基础上，通过混合发酵对已选定的菌种进行正交试验［16］，发酵所得SCP的产量作为确定菌种间最佳配比的标准，见表1。

表1 因素水平表Table 1Factors and levels table

根据试验方差分析所得的比例进行验证性试验，即在28℃，140r/min，24h环境下培养，并对发酵后的黄浆水在4000r/min下离心20min，后在75℃干燥箱中烘干至恒重，记录数据并对比。

2 结果与分析

2.1 菌种生长曲线

经过测定得各菌种的生长曲线见图1。

图1 各菌种的生长曲线Fig.1The growth curves of each specy

由图1可知，A和B在10～30h时达到对数期，在20h时菌种的活力最高，因此是接入的最佳时期；C和D在10～20h左右达到对数期，在15h时其活力最高，此时接入最为合适。

2.2 菌种发酵结果

经过单个菌种发酵，分别得出不同菌种的单细胞蛋白的产量为：白地霉0.96g/dL、扣囊拟内孢霉酵母0.58g/dL、产朊假丝酵母0.15g/dL、解脂假丝酵母0.38g/dL；由各个菌种的产量结果可知，白地霉的产量最多，产朊假丝酵母的产量最少。

遵循单菌发酵的条件，对4种菌株进行四因素三水平的正交组合，试验结果见表2。

表2 正交试验结果Table 2Results of the orthogonal experiment

由表2可知，理论上的最优组合为A3B1C1D1，A∶B∶C∶D为3∶1∶1∶1；由极差的大小可知，对SCP产量的影响大小因素为B＞D＞C＞A；即B的极差最大，说明扣囊拟内孢霉酵母的影响作用很大；其次是产朊假丝酵母，对SCP的产量影响也很大；再次是解脂假丝酵母；白地霉的极差最小，说明白地霉对产物结果的影响最小。

根据表2的结论进行方差分析，见表3。

表3 方差分析表Table 3Analysis of variance table

F检验结果表明：白地霉A和解脂假丝酵母C对SCP的产量有着显著的影响；扣囊拟内孢霉酵母B和产朊假丝酵母D有着极显著的影响；因此，各因素对试验指标影响的主次顺序为B＞D＞A＞C。

采用q检验法对各因素水平进行多重比较，见表4。

表4 各因素水平组合平均数多重比较（q法）Table 4Each factor level combination averages multiple comparisons（q test）

由表4可知，A因素中A2，A3差异不显著，且均优于A1，因此，选择A2或者A3均可；B因素中B1显著优于B2，B3且差异显著，因此选择B1；C因素中C1显著优于C2，C3且差异显著，因此选择C1；D因素中D2显著优于D1，D3，且差异显著，因此选择D2。

由以上分析得知4个试验因素的最优水平组合为A2B1C1D2或者A3B1C1D2，即白地霉∶扣囊拟内孢霉∶解脂假丝酵母∶产朊假丝酵母为2∶1∶1∶2或者3∶1∶1∶2。

根据正交分析的结果对两种最佳配比即白地霉∶扣囊拟内孢霉∶解脂假丝酵母∶产朊假丝酵母为2∶1∶1∶2或者3∶1∶1∶2进行相同环境下的发酵验证试验，重复3次，取平均值作为结果。经过烘干称重所得菌体的重量分别为1.102，1.076g/dL，比理论中的最佳比例下进行发酵的SCP产量分别高出14.7%和12.01%。

3 结论

通过对选取好的4株性能不同的菌株进行了单个发酵生产SCP研究，分别得出不同菌种的SCP的产量为：白地霉0.96g/dL、扣囊拟内孢霉酵母0.58g/dL、产朊假丝酵母0.15g/dL、解脂假丝酵母0.38g/dL。由此可知，白地霉的产量最多，其次是扣囊拟内孢霉，然后为解脂假丝酵母，产朊假丝酵母的产量最少。

在单因素的基础上，通过正交试验得知对SCP产量影响显著的主次因素为扣囊拟内孢霉＞产朊假丝酵母＞白地霉＞解脂假丝酵母，并确定了菌种间发酵的最佳配比为白地霉（SH501）∶扣囊拟内孢霉（CICC31258）∶解脂假丝酵母（CICC32457）∶产朊假丝酵母（CICC31268）为2∶1∶1∶2或者3∶1∶1∶2，以这两种比例进行混合接种发酵时SCP的产量最高。经过对4种菌株进行混合发酵得知，混合后的菌群所得SCP的产量比任意一株单菌发酵的SCP的产量都要高，在此条件下进行发酵所得的SCP产量明显提高，并且经过发酵后的黄浆水明显澄清，达到了废水净化的目的。说明利用不同特征的菌种进行混合发酵可以有效地利用黄浆水中的营养成分。

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Selection of Strain Producing SCP Fermented by Yellow Slurry Water

CHE Ying－jie，HAO Lin
（College of Food Science and Engineering，Shanxi Agricultural University，Jinzhong 030801，China）

Strains are selected to produce fermented single cell protein（SCP）with yellow slurry water as liquid media.The results show that the fermentation strains which can make full use of proteins，fats and saccharides，includingEndomycopsisfiburiger（CICC31258），Candidalipolytica（CICC32457），Candida utilis（CICC31268），Geotrichumcandidumlink（SH501）.Use single factor and orthogonal experiments to get the best ratio ofGeotrichumcandidumlink（SH501），Endomycopsisfiburiger（CICC31258），Candida lipolytica（CICC32457）andCandidautilis（CICC31268）is 2∶1∶1∶2or 3∶1∶1∶2.

soybean yellow slurry water；single cell protein（SCP）；ratio of strains

TS261.13

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.03.006

1000-9973（2017）03-0022-04

2016－09－27

企业横向联合项目

车颖洁（1992－），女，硕士，研究方向：食品生物技术；郝林（1957－），男，教授，博士，研究方向：食品微生物学。