发酵调味饮料酵母菌的筛选及其发酵性能研究

范洪臣，刘天，郑威，陈宁，辛嘉英

（1.哈尔滨商业大学食品科学与工程重点实验室，哈尔滨 150076；2.哈尔滨商业大学会计学院，哈尔滨 150076；3.哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨 150076）

发酵调味饮料酵母菌的筛选及其发酵性能研究

范洪臣1＊，刘天2，郑威3，陈宁3，辛嘉英1

（1.哈尔滨商业大学食品科学与工程重点实验室，哈尔滨 150076；2.哈尔滨商业大学会计学院，哈尔滨 150076；3.哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨 150076）

从当地制作面包面泥中分离酵母菌，以产酒精和3-羟基丁酮为参考指标，通过三级筛选，筛选出一株适合发酵调味饮料用的产酒低、产香性能优的酵母SD-01。通过个体形态、菌落特征、生理生化分析，SD-01鉴定为酿酒酵母。将SD-01接入到麦汁培养基中，不同温度下产3-羟基丁酮、酒精不同，其中26℃下发酵条件最好，其酒精量为0.98g/dL，3-羟基丁酮最高为0.97g/L。在26℃下研究了菌种生长、代谢还原糖、产酸、产酒、产3-羟基丁酮的规律，为发酵生产提供借鉴。最终筛选的酵母菌因其产酒低、3-羟基丁酮高加之发酵产生丰富的有机酸，为发酵调味饮料生产提供了一株发酵性能良好的酵母。

筛选；酵母；发酵调味饮料；酒精；3-羟基丁酮

近年来，传统的碳酸饮料、新兴的茶饮料、果汁饮料、蔬菜汁饮料、发酵调味饮料这些功能性饮料快速发展。其中，发酵调味饮料也不断走向成熟，新技术不断发展，迎合消费者口味和理念的新产品不断涌现［1］。发酵调味饮料是一种饮料原料通过乳酸菌、酵母菌或其他允许使用的菌种发酵后调配，酒精含量在1%（体积分数）以下的饮料［2］。发酵调味饮料在发酵过程中微生物代谢产生很多小分子有机物，如有机酸、维生素等，这些有机物易于人体吸收，有利于人的身体健康，还具有抑菌作用，可以延长饮料的保质期［3］；同时酵母也具有广泛的营养和应用价值，它具有高的蛋白质、完全的氨基酸、丰富的B族维生素、全面的生理活性物质如各种辅酶、细胞色素、凝血质、谷胱甘肽等［4］，酵母里的微量元素硒、铬能抗衰老、抗肿瘤、预防动脉硬化，并能提高人体的免疫力，因此酵母菌对于发酵调味饮料来说相当重要。虽然酵母为发酵调味饮料带入了诸多优点，但是也有其弊端，一是由于大多数酵母产酒能力较强，导致发酵结束后酒精含量较高，不符合发酵调味饮料的定义，后期对酒精的处理成为棘手的问题；二是风味不突出，虽然大多数酵母产生有机酸，但产香味物质较少，因此在发酵调味饮料调配中加入一些人工合成的香料弥补发酵调味饮料风味不足。随着人们饮食习惯的改变，对人为合成的香料越来越排斥，因此筛选适合发酵调味饮料应用的产低酒精和高香味的酵母尤为重要。

目前大多数文献报道集中在高产酒精酵母［5，6］、果酒类酵母［7－10］筛选上，单纯筛选发酵调味饮料用酵母尤其是产酒精低、风味高的文章还没见报道。2，3，5-氯化苯基四氮哇（TTC）平板法是筛选高产酒精酵母的常用方法，TTC作为显色剂与酵母的代谢产物发生呈色反应，颜色深的菌株呼吸酶活力强，有较强的产酒精能力，进而判断酵母产酒精能力的高低。本研究对TTC筛选高产酒精酵母的方法进行逆向思维，选择颜色浅、呼吸酶弱、有较弱产酒能力的酵母。3-羟基丁酮也称乙偶姻、甲基乙酰甲醇，主要应用于奶油、乳品、酸奶和草莓型饮料等食品行业。此外，3-羟基丁酮在化工、制药、IT等行业也有广泛应用。目前为止，化学法、酶法以及微生物发酵法是生产3-羟基丁酮的主要方法，在3种方法中，微生物发酵法凭借原料广泛、反应条件温和、绿色等优点而备受关注。3-羟基丁酮的测定原理是在碱性介质中，3-羟基丁酮与含胍基的化合物反应生成红色化合物，甲萘酚促进红色化合物生成，红色化合物在可见光500～600nm有较强的光吸收，吸光值与3-羟基丁酮浓度在一定浓度范围内成正比［11］。本研究根据测定3-羟基丁酮的原理，向发酵后的小玻璃管中加入3-羟基丁酮显色剂，颜色深者为高产3-羟基丁酮菌株，利用此方法可以简单、方便地筛选高产3-羟基丁酮酵母。通过3次筛选得到了酒精产量低、3-羟基丁酮含量高的酵母，对该酵母进行了初步鉴定并对其生产性能进行了研究，为筛选发酵调味饮料用酵母提供了方法借鉴，同时也为发酵调味饮料生产提供了借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 酵母菌种来源

酵母菌筛选材料来源于哈尔滨本地生产大列巴用的面泥。

1.1.2 一级筛选培养基

TTC上层培养基：参考文献［12］TTC上层培养基配制。

TTC下层培养基：琼脂15g，麦汁糖化液1000mL。

1.1.3 二级筛选培养基

麦汁糖化液。

1.1.4 三级筛选培养基

麦汁糖化液。

1.2 方法

1.2.1 富集培养

将面泥加入装有100mL水及玻璃珠灭菌后的500mL锥形瓶中，用振荡器振荡1h，打碎面泥，释放游离菌，振荡后从菌悬液中取5mL样品加入到灭菌后的含100μg/mL青霉素的麦汁中，26℃培养24h，镜检。若全为酵母则取1mL接入TTC筛选平板。

1.2.2 酵母菌的筛选

1.2.2.1 一级筛选

采用TTC法，将富集的酵母接入到TTC平板上，28℃培养48h，将TTC显色剂覆盖到底层培养基上生长的酵母菌落，继续28℃培养16h。颜色的深浅代表产酒精能力，深红色的酵母菌落产酒能力强，浅粉或无色产酒能力弱。将分离得到的各菌株根据上述方法试验重复3次，初筛出产酒低性状的酵母菌株。

1.2.2.2 二级筛选

将一级筛选得到的酵母接种到装有麦汁培养基的玻璃试管中28℃培养48h，根据3-羟基丁酮测定原理，加入1mL 10%NaOH、0.5%肌酸、5%甲萘酚，4h后观察试管颜色，颜色变红的试管对应高产3-羟基丁酮菌株。将分离得到的各菌株根据上述方法试验重复3次，筛选出高产3-羟基丁酮的菌株。

1.2.2.3 三级筛选

将二级筛选出的菌株按接种量6×106cfu/mL接入麦芽汁培养基中，28℃发酵48h后测定酒精和3-羟基丁酮含量，试验重复3次，复筛得到性状最为优良的菌株。

1.3 酵母菌的鉴定

形态特征鉴定：菌种个体形态和菌落特征。

生理生化试验：根据《酵母菌的特征与鉴定手册》［13，14］进行生理生化鉴定。

1.3.1 发酵性能的研究

不同温度下产酒精能力的研究：将筛选出的菌株按接种量6×106cfu/mL接入麦芽汁培养基中，不同培养温度22，26，30℃，发酵48h后测定酒精和3-羟基丁酮含量，考察不同温度下该酵母的产酒精、3-羟基丁酮能力。

发酵性能的研究：将筛选出的菌株按接种量6×106cfu/mL接入麦芽汁培养基中，26℃下培养，发酵培养4，12，16，20，24，28h后测定该菌产酸、耗糖、产酒、产3-羟基丁酮指标。

1.3.2 测量方法

1.3.2.1 酒精的测定

酒精的测定采用GB/T 13662－2008方法测定。

1.3.2.2 3-羟基丁酮测定

3-羟基丁酮测定根据文献［11］方法测定。

1.3.2.3 酸度测定

酸度用pH计直接读数。

1.3.2.4 还原糖测定

还原糖用斐林试剂滴定法测定［15］。

2 结果分析

2.1 筛选结果

富集主要目的是将面泥中的酵母筛选出来，本实验将采集的样品置于100μg/mL青霉素麦汁培养基中，经培养将面泥中乳酸菌、醋酸菌等细菌淘汰，将酵母保留下来。

2.2 酵母菌的筛选

根据一级筛选的方法，及时观察菌落的颜色变化，比较各菌株间的颜色深浅，其效果见图1。

图1 TTC平板筛选产低酒精酵母Fig.1The screening of low alcohol yeast on TTC plate

由图1可知，平板中大多数酵母是红色的，颜色较深，但有个别的酵母菌落颜色很浅，甚至无色，此类酵母菌同其他酵母相比菌落较小，呼吸酶可能较弱，有较弱的产酒能力，导致与TTC反应颜色较浅。通过一级筛选共得到48株酵母。

根据二级筛选的方法，及时观察各菌管的颜色变化，比较各菌管的颜色深浅，其效果见图2。

由图2可知，菌种产3-羟基丁酮，可以根据玻璃试管粉颜色的深浅判断，产3-羟基丁酮越多，粉颜色越深，最终由一级筛选方法挑选出的48菌株经二级筛选得到12株酵母，这12株酵母从一级、二级筛选效果看既产酒低又高产风味物质3-羟基丁酮。

根据三级筛选的方法以产酒、3-羟基丁酮为指标，选出了一株既产酒低又高产3-羟基丁酮的酵母，命名为HS-01，在7°Bix麦汁下发酵液酒精含量为0.96g/dL，比对照的商用产酒酵母产酒精含量2.56g/dL低很多，满足了发酵调味饮料低酒精的要求。生成的风味物质3-羟基丁酮含量达到0.93g/dL。故经过三级筛选得到的HS-01完全达到了发酵调味饮料的要求。

2.3 菌种鉴定

2.3.1 形态特征观察

图3 HS-01菌株的形态（40×10）Fig.3Figure of HS-01（40×10）

由图3可知，在麦汁平板培养基25℃培养24h，经高倍显微镜观察，HS-01为椭圆形，大小1.5～2.5μm× 2.5～8μm。

2.3.2 菌落特征

图4 HS-01菌株菌落特征Fig.4Colony characteristics of strain HS-01

由图4可知，HS-01菌株菌落颜色乳白色，挑起粘稠，外观光滑、平整、有隆起。

2.3.3 生理生化鉴定

HS-01菌株能发酵葡萄糖、蔗糖、半乳糖和棉子糖，不发酵乳糖；能同化棉子糖、麦芽糖、半乳糖、甘露糖、山梨糖、海藻糖、纤维二糖、乙醇、甘油、菊粉、D-甘露醇、α-甲基-葡萄糖苷、水杨苷、柠檬酸、琥珀酸；不能同化乳糖、D-木糖、D-核糖、蜜二糖、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、可溶性淀粉、乳酸、赤藓醇、肌醇和核糖醇；不能同化硝酸钾和亚硝酸钠，盐酸乙胺和盐酸尸胺同化为阴性，在无维生素培养基上能生长，37℃能生长，50%葡萄糖能生长，产淀粉试验为阴性。放线菌素酮抗性试验为阴性。根据HS-01菌株的形态、生理生化试验，结合《酵母菌的特征与鉴定手册》，可将HS-01菌株鉴定为酿酒酵母。

2.4 HS-01酵母菌的发酵性能

为了确保筛选得到的菌株能够用于发酵调味饮料实际生产，对酵母HS-01菌株的生长特性产酸、耗糖、产酒和产3-羟基丁酮能力进行研究，为发酵生产提供借鉴。

2.5 温度对HS-01产酒精、3-羟基丁酮的影响

在22，26，30℃下HS-01产酒精、3-羟基丁酮能力见图5和图6。

图5 不同温度下HS-01产酒精能力Fig.5Alcohol production ability of HS-01 at different temperatures

图6 不同温度下HS-01产3-羟基丁酮能力Fig.6Acetoin production ability of HS-01 at different temperatures

由图5可知，随着温度的升高，酒精含量呈先升后降的趋势，酒精含量在26℃最高，达到了0.98g/dL。

由图6可知，随着温度的升高，3-羟基丁酮含量呈先升后降的趋势，3-羟基丁酮含量在26℃最高，达到了0.97g/L。从产酒结果看，在低温22℃和高温30℃时产酒能力较弱，低温时酵母生长较慢导致酒精含量低，高温时温度影响了酵母中合成酒精的代谢酶类活性从而影响了产酒精能力。但从产3-羟基丁酮能力看，26℃产量最高，可能在26℃下合成3-羟基丁酮的酶类代谢活跃。综合酒精和3-羟基丁酮这两个指标，发酵温度26℃对发酵生产更有力，有益于获得香气好、酒精度适合的发酵调味饮料。

2.6 HS-01产酸规律

图7 HS-01产酸曲线Fig.7Acid yield curve of HS-01

由图7可知，随着发酵的进行，pH逐渐变低，尤其是在16～24hpH下降最快，在28hpH达到3.5。这说明HS-01在发酵过程中具有较强的产酸能力，通过品尝，酸味较柔和，由此带来良好的酸味，丰富了发酵调味饮料风味，为发酵调味饮料的后期调制和新产品开发提供了有利因素。

2.7 HS-01耗糖规律

图8 HS-01耗糖曲线Fig.8The curve of HS-01sugar consumption

由图8可知，随着发酵时间的增长，还原糖含量不断降低，其中在16～28h还原糖降速最快，综合产酸曲线、产酒曲线和产3-羟基丁酮曲线，HS-01利用还原糖主要在这个阶段合成了有机酸、酒精和3-羟基丁酮，所以耗糖速度较快。

2.8 HS-01产酒精规律

图9 HS-01产酒精曲线Fig.9The curve of HS-01alcohol production

由图9可知，随着发酵时间的增长，酒精含量逐渐升高，尤其是在16～24h酒精含量升速最快，在28h达到0.98g/dL。

2.9 HS-01产3-羟基丁酮规律

图10 HS-01产3-羟基丁酮曲线Fig.10The curve of HS-01acetoin production

由图10可知，随着发酵时间的增长，3-羟基丁酮含量逐渐升高，28h达到最高，为0.97g/L。3-羟基丁酮4h时开始出现，至28h基本结束，在16～28h生成速率增快，与菌体的生长、耗糖相对应，说明HS-01产3-羟基丁酮是随着菌体的生长而产生的。由于HS-01原始菌株产3-羟基丁酮较高，可以考虑在将来的研究中用该菌种直接生产天然的香料3-羟基丁酮。

3 结论

从生产面包的面泥中利用三级筛选的方法得到了一株产酒精低、3-羟基丁酮高的酵母菌HS-01，通过对其发酵性能进行研究，HS-01在26℃时产酒精0.98g/dL，3-羟基丁酮0.97g/L，产酸也比较好，是一株能够用于发酵调味饮料的良好菌种。经过生理生化鉴定HS-01为酿酒酵母。随着发酵调味饮料的发展，国内饮料企业已将发酵菌种、发酵调味饮料的生产及新型发酵调味饮料的开发作为重点，因此，HS-01用于发酵调味饮料生产及开发新型发酵调味饮料产品是我们将来主要研究的内容。

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Screening of Yeast for Fermented Drink Production and Research on Yeast Fermentation Capability

FAN Hong-chen1＊，LIU Tian2，ZHENG Wei3，CHEN Ning3，XIN Jia-ying1
（1.Key Laboratory for Food Science ＆Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China；2.College of Accounting，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China；3.Center of Research and Development on Life Sciences and Environmental Sciences，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China）

A strain of yeast named SD-01for fermented drink production is screened from the bread dough with different grades of maturity after three level screening.The content of alcohol and acetoin is determined by three level screening.SD-01is identified asSaccharomycescerevisiaeon the basis of morphological characteristics，colony morphology，physiological and biochemical tests.The result indicates that the optimal fermentation temperature is 26℃，with alcohol of 0.98g/dL and acetoin of 0.97g/L.The fermentation technique of metabolism reducing sugar，acid production，alcohol production，acetoin production is researched at 26℃.SD-01has low alcohol，high acetoin and rich organic acids，is feasible for fermented drink production.

screening；yeast；fermented drink；alcohol；acetoin

TS261.13

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.03.007

1000-9973（2017）03-0026-05

2016－09－09 ＊通讯作者

黑龙江省科技厅项目（GC12B403）

范洪臣（1978－），男，黑龙江哈尔滨人，助理工程师，博士，研究方向：食品科学。