肢体缺血后处理对局灶性脑缺血再灌注大鼠 Caspase-3 和细胞凋亡的影响

韦家俊 李 浩 廖小明 吴 岚 王耀辉 刘开祥

(桂林医学院附属医院神经内科，广西 桂林 541001)

肢体缺血后处理对局灶性脑缺血再灌注大鼠 Caspase-3 和细胞凋亡的影响

韦家俊 李 浩 廖小明 吴 岚 王耀辉 刘开祥

(桂林医学院附属医院神经内科，广西 桂林 541001)

目的 探讨肢体缺血后处理(Lpost)对大鼠局灶性脑缺血再灌注区半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3和细胞凋亡的影响。方法 健康雄性SD大鼠36只，随机分为假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(I/R组)、肢体缺血后处理组(Lpost组)，I/R组、Lpost组均行缺血2 h再灌注24 h局灶性脑缺血再灌注模型。Lpost组再灌注前实施肢体缺血后处理(缺血15 min，灌注15 min)3个循环。各组大鼠神经功能评分，采用四氮唑红(TTC) 染色确定脑缺血半暗带位置，TUNEL 测定细胞凋亡，免疫组化测定 Caspase-3 的表达变化。结果 Sham组神经缺损评分为 0 分；与 Lpost 组(1.20 ± 0.41)比较，I/R 组神经功能缺损较重(2.40±0.51，P<0.05)；TTC 染色证实缺血半暗带位于大脑矢状裂至外侧裂上1/3的皮质组织。与Sham组相比，I/R组、Lpost 组缺血半暗带内凋亡细胞数、Caspase-3表达均明显增加(P< 0.05)，且I/R组表达明显增强，高于Lpost组(P<0.05)。结论 肢体Lpost可减轻脑缺血再灌注损伤诱导的细胞凋亡，缓解神经细胞的坏死，其作用机制可能与减少 Caspase-3 表达有关。

缺血再灌注；肢体缺血后处理；细胞凋亡；半胱氨酸蛋白酶-3

肢体缺血后处理(Lpost)是近年来发现的可以减少脑缺血再灌注损伤的方法。以往研究证实〔1〕，Lpost 可以减少脑缺血再灌注后的脑梗死体积，但其调节机制尚不十分清楚。本实验参照 Zea Longa 线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，通过观察 Lpost 对半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3和细胞凋亡的影响，探讨 Lpost 减少脑缺血再灌注损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 主要药品及试剂 TUNEL 法细胞凋亡检测试验盒购于罗氏公司、DAB显色试剂盒及Caspase-3兔多克隆抗体均由武汉博士德生物工程有限公司提供。

1.2 实验动物分组 SPF 级雄性SD大鼠36只(体质量240～260 g)，由广西医科大学试验动物中心提供。随机分为假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(I/R组)、肢体缺血后处理组(Lpost组)，I/R 组、Lpost 组均行缺血 2 h再灌注 24 h 局灶性脑缺血再灌注模型。Lpost组阻断大脑中动脉2 h后，于再灌注时夹闭双下肢动脉15 min，松开15 min，反复3次。

1.3 局灶性脑缺血再灌注模型的制备 采用改良的MCAO模型制备方法〔2〕，步骤如下：大鼠用10%水合氯醛(300 mg/kg i.p.)麻醉，取颈部左旁正中切口3～4 cm，分离左侧颈总动脉(CCa)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)，双极电凝器凝断 ECA 及其分支，用动脉夹夹闭 ICA、CCA 近心端，在ECA分叉远心端用眼科剪斜行剪一倒“V”小口并导入栓线，栓线自左ECA 插入CCA分叉处，固定线栓、调整方向，将线栓插入左ICA，松开动脉夹，缓慢推进，稍感阻力即止，此时插入深度约为18～19 mm。缺血120 min抽出线栓完成MCAO/R模型。Sham组：不做脑缺血，栓线插入深度<9 mm。

1.4 神经功能缺损评分 大鼠脑缺血2 h 再灌注24 h，进行神经功能缺损评分。参照Longa 等〔3〕神经功能缺损评分标准：无神经功能缺损为0分；病灶对侧前肢不能完全伸直为1分；行走向瘫痪侧旋转为2分；身体向瘫痪侧跌倒为3分；出现意识障碍为4分。神经功能缺损达1～3分者视为模型制作成功。

1.5 脑梗死体积测定 缺血2 h再灌注24 h，各组随机取6只大鼠，过度麻醉后取脑，-4℃ 冷藏10 min，冠状切面切成均匀的5片，每片约3 mm，置于2% TTC溶液避光温育、多聚甲醛液固定。梗死灶区呈白色，正常呈红色。利用CAD处理软件，计算出各缺血侧的总体积和梗死区的体积，再求梗死区占半球总体积的百分比。

1.6 TUNEL染色及Caspase-3染色 缺血2 h再灌注24 h，各组随机取6只大鼠，用10%水合氯醛对大鼠进行麻醉。夹闭腹主动脉，用4℃生理盐水经左心室穿刺灌注，待右心耳充盈后将其剪开，灌注约100 ml后，再用4%多聚甲醛磷酸缓冲液200～300 ml灌洗固定，断头取视交叉前后2 mm脑组织，中性甲醛固定48 h，经石蜡包埋、切片。按试剂盒说明书进行TUNEL染色，胞核出现棕黄染色颗粒为TUNEL阳性细胞。再采用SP法检测Caspase-3的表达，具体操作均按试剂盒说明书进行，胞核出现棕黄染色颗粒为阳性细胞。两种染色每张切片观察10个高倍镜视野(×400)，计算平均每张切片的阳性细胞数。

1.7 统计学方法 采用SPSS19.0软件行单因素方差分析。

2 结 果

2.1 神经功能缺损评分 Sham组神经行为学评分为0分；与I/R组比较，Lpost组神经功能缺损较轻(P<0.05)，见表 1。

表1 各组大鼠神经功能缺损评分、脑梗死体积及 Caspase-3阳性细胞数比较

与Sham组比较：1)P<0.05；与Lpost组比较：2)P<0.05

2.2 脑梗死体积测定 TTC 染色后，缺血梗死区脑组织呈白色，主要分布在矢状裂至外侧裂下2/3的皮质以及视交叉前后3 mm之间；矢状裂至外侧裂上1/3的皮质区呈现白色向红色的过渡，为缺血半暗带的区域；正常脑组织被染成红色。与Lpost组比较，I/R组脑梗死体积较大(P<0.05)，见表 1。

2.3 各组大鼠神经元凋亡的比较 Sham组可见少量的凋亡细胞；与I/R组凋亡细胞数(27.83±2.93)%相比，Lpost组凋亡细胞数明显减少〔(17.67±2.16)%,P<0.05〕，见图1。

2.4 Caspase-3阳性细胞数比较 Caspase-3主要分布于神经元，镜下见胞质、胞核棕黄色着色为阳性，见图2。Sham组仅有少量Caspase-3阳性表达；与I/R组比较，Lpost组 Caspase-3阳性细胞数明显减少(P<0.05)，见表1。

图1 各组大鼠缺血区脑组织TUNEL阳性细胞(×400)

图2 各组大鼠缺血区脑组织 Caspase-3的表达(DAB，×400)

3 讨 论

研究表明〔4〕，缺血中心区神经元的坏死和缺血半暗带神经元的凋亡是缺血性脑卒中后神经元的死亡主要表现形式。然而，缺血半暗带的脑组织损伤具有可逆性，如何有效干预缺血半暗带区神经元的凋亡已然成为研究的热点。本研究结果证实，肢体缺血后处理减少大鼠脑缺血半暗带区神经元凋亡数量，且下调相应区域 Caspase-3 的表达，从而发挥缺血再灌注后脑保护的作用。

Lpost对缺血脑组织具有保护作用，但是其保护机制尚不明确。Sun等〔5〕在大鼠脑缺血模型中发现，肢体缺血后处理可通过神经途径发挥脑保护作用。本实验结果表明，Lpost 减轻脑缺血损伤可能是通过协同缺血诱导的细胞凋亡机制介导的。半胱氨酸蛋白酶(Caspases)作为细胞凋亡过程的重要蛋白酶在凋亡的最后实施过程中起决定性的作用，而 Caspase-3 作为多种凋亡程序启动的执行者，有着非常重要的意义和作用〔6〕。以往研究证实〔7〕，抑制 Caspase-3 的活性对缺血性脑损伤具有较明显的神经保护作用。Caspase-3作为 Caspases 家族重要的成员，在细胞内以前体的形式存在。研究发现〔8〕，激活细胞凋亡途径可以介导 Caspase-3 前体表达及活化水平的上调。本研究结果提示，Lpost 可以介导局灶性脑缺血再灌注大鼠缺血半暗带区 Caspase-3 表达的下调，减小脑组织梗死的体积，减轻神经功能缺损评分，抑制神经元发生进行性损伤，从而对脑缺血后神经细胞起到保护作用。

综上，肢体缺血后处理可以减轻局灶性脑缺血再灌注缺血半暗带区神经元的凋亡，具有神经保护的作用，有利于缺血半暗带的转归，其机制可能与下调缺血半暗带 Caspase-3 的表达有关。

1 韩 冬，白 洋，马 爽，等.缺血后处理对大鼠缺血再灌注后星形胶质细胞的影响〔J〕.中国老年学杂志，2013；33(8)：1854-5.

2 王耀辉，李国辉，冯华坤，等.线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的体会与评价〔J〕.中国煤炭工业医学杂志，2013；16(10)：1686-8.

3 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989；20(1)：84-91.

4 张红明，曾子玲，李晓燕.线粒体依赖的凋亡通路与缺血性脑卒中〔J〕.中华老年心脑血管病杂志，2013；15(7)：778-80.

5 Sun XC，Li WB，Li QJ，etal.Limb ischemic preconditioning induces brain ischemic tolerance via p38 MAPK〔J〕.Brain Res，2006；1084(1)：165-74.

6 Dejonckheere E，Vandenbroucke R，Libert C.Matrix metalloproteinases as drug targets in ischemia/reperfusion injury〔J〕.Drug Discovery Today，2011；16(17)：762-78.

7 高维娟，张 霞，刘莎莎.大鼠脑缺血再灌注后海马 CA1 区 Caspase-3 的表达及细胞凋亡的动态变化〔J〕.中国老年学杂志，2013；33(24)：6202-4.

8 庄 严，王丹丹，柳忠兰，等.吸烟对大鼠局灶性脑缺血后Caspase-3表达及细胞凋亡的影响〔J〕.中国老年学杂志，2014；34(1)：156-8.

〔2015-10-10修回〕

(编辑 赵慧玲/曹梦园)

广西省自然科学基金(2012jjAA40148)；桂林市科技开发项目(0110119-1-6)

韦家俊(1976-)，男，主治医师，硕士，主要从事脑血管疾病研究。

R743

A

1005-9202(2017)04-0804-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.009