骨髓间充质干细胞局部移植对兔腹主动脉成形术后再狭窄和平滑肌细胞增殖的影响

王庆元 吴向军 张晓燕 崔家玉

(滨州医学院附属滨州市人民医院心内科，山东 滨州 256600)

骨髓间充质干细胞局部移植对兔腹主动脉成形术后再狭窄和平滑肌细胞增殖的影响

王庆元 吴向军 张晓燕 崔家玉

(滨州医学院附属滨州市人民医院心内科，山东 滨州 256600)

目的 探讨兔腹主动脉血管成形术后，骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对兔腹主动脉再狭窄和平滑肌细胞增殖的影响及机制。方法 将60只新西兰大白兔随机分为对照组、损伤组、移植组各20只。所有动物均穿刺股动脉，对照组不进行球囊扩张损伤腹主动脉，损伤组和移植组送入球囊扩张损伤腹主动脉，损伤组注射等量的磷酸盐缓冲液(PBS)，移植组用经4，6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)荧光标记的BMSCs以1×107/kg的细胞数经血管注射到损伤血管的局部。术后4 w取腹主动脉行免疫组织化学染色检测平滑肌肌动蛋白(α-SM-actin)、增殖细胞核抗原(PCNA)在血管内膜上的表达情况，测定PCNA阳性细胞核数量，计算PCNA增殖指数。HE染色行血管形态计量分析包括内膜中膜厚度、内膜中膜面积，衡量血管狭窄情况。结果 损伤组新生血管内膜层α-SM-actin表达明显强于对照组(P<0.05)，移植组新生血管内膜α-SM-actin表达，与损伤组比较明显增强(P<0.05)。对照组血管内膜无PCNA阳性表达，损伤组PCNA阳性细胞数较对照组明显增多(P<0.05)。移植组PCNA阳性细胞数较损伤组明显减少(P<0.05)。损伤组腹主动脉明显狭窄，内膜厚度、内膜面积、中膜厚度、中膜面积、血管狭窄程度等指标明显高于移植组和对照组(P<0.05)，移植组腹主动脉有所狭窄，但血管形态学指标与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 兔腹主动脉球囊损伤后导致血管平滑肌细胞增殖及动脉管腔狭窄。BMSCs血管局部移植可抑制血管平滑肌细胞的增殖，减轻动动脉粥样硬化及狭窄程度。

骨髓间充质干细胞；腹主动脉；平滑肌细胞；增殖；再狭窄

血管再狭窄是冠状动脉介入治疗的主要和严重的并发症，目前其发病机制尚不明确，研究表明，血管内膜损伤后，平滑肌细胞的迁移、增殖和细胞外基质的分泌是再狭窄发生的主要机制〔1〕。另外，炎性细胞的浸润造成血管的炎症反应，使血管内皮损伤、血管僵硬度增加、血管平滑肌细胞增殖在血管再狭窄过程中也起了十分重要的作用〔2〕。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是一种来源于中胚层的多能干细胞，具有多项分化潜能，可向内皮细胞分化，参与损伤血管内膜的修复，在抑制血管平滑肌细胞增殖，减轻再狭窄过程中可能起到一定作用，但具体机制不明。本研究通过血管局部移植BMSCs，探讨对兔腹主动脉再狭窄和平滑肌细胞增殖的影响及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器 健康8～12月龄新西兰大白兔60只，雌雄不拘，体重2.5～3.50 kg，由山东大学医学院实验动物中心提供。小鼠抗兔平滑肌肌动蛋白(2-Sm-actin)抗体购自美国Neomarker公司，小鼠抗兔增殖细胞核抗原(PCNA)购自美国Zymed公司，小鼠抗兔CD34、CD90抗体购自中杉金桥公司，4，6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)购自迈新生物技术开发有限公司，双目光学显微镜、石蜡切片机(LX-75)及计算机图像分析系统来自德国Leica公司。

1.2 动物分组损伤模型的建立 实验动物随机分为对照组、损伤组、移植组，每组20只。动物术前8 h禁食，不禁水，称体重量。常规建立耳缘静脉输液通路，以3%戊巴比妥1 ml/kg耳缘静脉注射麻醉实验动物，麻醉后动物背位固定于手术台，双侧腹股沟区用10%硫化钠脱毛。常规消毒铺巾后，Seldinger技术穿刺股动脉并留置鞘管，经鞘管注入普通肝素200 U抗凝，沿鞘管送入球囊导管至主动脉弓处，肝素生理盐水充盈球囊10～12 atm(1 atm =760 mmHg)，后自近心端缓慢回拉球囊，同时降低球囊内压力，保持球囊回撤维持一定阻力，上述过程持续约1 min，每次球囊扩张持续时间约30 s，间隔20 s后回缩球囊后再次送入球囊导管，反复3次，撤出球囊导管，同时拔除动脉鞘管，压迫止血15～20 min后，绷带加压包扎固定，4～6 h后解除绷带包扎。

1.3 BMSCs的分离、培养、鉴定、标记和移植 在无菌条件下通过骨髓穿刺兔股骨抽取骨髓液，将采集到的骨髓液离心后用10%的胎牛血清、100 U/ml的青霉素和链霉素的DMEM培养基培养，在二氧化碳培养箱中孵育，原代培养3 d后开始更换培养液，BMSCs增殖到90%时传代，第3代BMSCs备用。取第3代BMSCs与用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的CD34、CD90抗体在37℃的培养箱中孵育30 min，用1%的多聚甲醛固定，行流式细胞仪检测。移植前将DAPI加入细胞悬液中，同样在37℃的培养箱中孵育30 min，将培养的BMSCs进行标记，放入PBS冲洗瓶中去除细胞表面非特异结合的DAPI。移植组从球囊导管交换导丝侧孔按1×107/kg的细胞数将标记好的BMSCs注入损伤血管处，同时抽取1 ml生理盐水将导管内的BMSCs冲入兔主动脉内，保留30 min后撤出球囊，损伤组注入等量的PBS液，对照组只进行股动脉穿刺和留置鞘管，不进行球囊损伤。

1.4 移植的BMSCs向血管内膜归巢的检测 术后1 w取材，荧光显微镜下观察到血管内膜上有DAPI标记的BMSCs即为归巢的BMSCs。

1.5 免疫组织化学检测和组织形态学分析 术后4 w取材血管组织，行α-SM-actin和PCNA免疫组织化学染色。在石蜡切片血管环上，首先滴加小鼠抗兔PCNA，α-SM-actin(1∶200倍稀释)，阴性对照滴加PBS缓冲液，4℃孵育过夜，再用山羊抗兔37℃孵育30 min，PBS冲洗，DAB显色，观察各组血管内膜PCNA，α-SM-actin表达情况。对石蜡切片进行HE染色，用计算机图像处理系统测量内膜厚度(IT)、内膜面积(IA)、中膜厚度(MT)、中膜面积(MA)，计算血管狭窄程度。

1.6 统计学方法 应用SPSS16.0统计软件进行χ2检验及t检验及单因素方差分析。

2 结 果

2.1 BMSCs的培养、鉴定及归巢 流式细胞仪检测结果提示BMSCs CD90的表达率为96.73%，CD34为0.21%。术后1 w，荧光显微镜下可观察到细胞核呈蓝色荧光的BMSCs 归巢到受损伤的血管内膜处(图1)。

图1 BMSCs的归巢

2.2 各组主动脉HE染色观察结果 对照组血管壁厚度均一，腔面有单层内皮细胞，细胞呈紫蓝色；血管内膜光滑，未见平滑肌细胞，中膜平滑肌细胞呈梭型，管腔无明显狭窄。损伤组显微镜下于损伤处内膜可见大量平滑肌细胞增生，排列方向乱而不规则，增生内膜厚度极不均匀，腔面不规整，中膜明显变厚，管腔明显狭窄。移植组显微镜下亦可见新生内膜形成，内膜和中膜变厚，中膜可见平滑肌细胞增生，管腔亦变狭窄，平滑肌细胞有中膜迁移至内膜下，但平滑肌细胞增生及血管狭窄程度均明显轻于损伤组。见图2。

2.3 各组α-SM-actin免疫组织化学染色结果 光镜下观察对照组血管内膜则无α-SM-actin阳性表达，血管中膜可见α-SM-actin阳性表达增强，染色呈棕黄色。损伤组新生血管内膜层有α-SM-actin阳性强表达，明显强于对照组〔(0.189±0.035)vs(0.011±0.003),P<0.05〕。移植组新生血管内膜中可见α-SM-actin阳性表达，与损伤组比较明显增强〔(0.451±0.035)vs(0.189±0.035),P<0.05〕。见图3。

2.4 各组间PCNA免疫组织化学染色及阳性细胞数比较 光镜下观察对照组血管内膜无PCNA阳性表达，损伤组新生血管内膜中可见PCNA阳性强表达，并向管腔面聚集，PCNA阳性细胞数较对照组明显增多〔(21.40±3.75)个 vs(6.25±1.35)个,P<0.05〕。移植组血管内膜亦可见PCNA阳性表达，但PCNA阳性细胞数较损伤组明显减少〔(11.32±3.15)个 vs(21.40±3.75)个,P<0.05〕。见图4。

2.5 各组兔4 w后内膜中膜厚度面积及狭窄程度比较 见表1。损伤组IT、MT、IA、MA及狭窄程度均明显高于对照组和移植组(均P<0.05)，移植组上述指标高于对照组，但差异无统计学意义(均P>0.05)。

图2 各组兔腹主动脉染色结果(HE，×200)

图3 各组兔腹主动脉α-SM-actin免疫组织 化学染色结果(DAB，×400)

图4 各组兔腹主动脉PCNA免疫组织化学 染色结果(DAB，×400)

指标对照组损伤组移植组IT(mm)0.48±0.061.59±0.311)2)0.59±0.09MT(mm)1.56±0.172.38±0.521)2)1.79±0.27IA(mm2)1.01±0.134.39±1.131)2)1.23±0.46MA(mm2)2.75±0.776.74±1.461)2)3.12±1.17IT/MT(%)41.05±7.7772.35±9.771)2)47.13±6.81IA/MA(%)39.95±5.9975.08±7.261)2)43.14±5.33狭窄(%)21.05±8.5482.08±11.841)2)30.35±10.37

与对照组比较：1)P<0.05；与移植组比较：2)P<0.05

3 讨 论

血管损伤后的血管内膜的异常增生在血管再狭窄过程中起了重要的作用，如在动脉粥样硬化及再狭窄的过程中，血管平滑肌的迁移、异常增殖和大量细胞外基质的分泌是起重要环节。因此，修复内膜，有效抑制血管平滑肌的增殖可减轻血管内狭窄的程度。

BMSCs 主要来源于胚胎时期的中胚层，不仅易于体外扩增，还具有多种分化能力，在诱导剂的体外诱导下，BMSCs 可向内皮细胞分化，修复受损伤的内膜〔3〕。在BMSCs 与平滑肌细胞共培养的实验中发现〔4〕，平滑肌细胞的迁移、增殖能力明显下降，说明BMSCs在一定程度上抑制了平滑肌细胞的增殖。Wu等〔5〕建立大鼠心肌梗死模型，将BMSCs 注射到大鼠梗死相关血管内，2 w后病理组织学研究显示，梗死血管的血栓负荷明显减轻，血管出现再通趋势，同时冠状动脉的狭窄程度有所减轻。刘志江等〔6〕研究发现球囊损伤兔颈总动脉后移植BMSCs 于血管损伤处，4 w后行劲总动脉血管造影显示，移植组血管狭窄程度较对照组明显减轻，由此得出BMSCs移植减轻血管再狭窄的结论。Foteinos等〔7〕将BMSCs移植到ApoE基因敲除的小鼠的动脉粥样硬化区域，发现BMSCs减轻了了动脉粥样硬化的程度，延缓了狭窄的发生。本研究在兔腹主动脉损伤后行BMSCs移植发现移植组可见细胞核呈蓝色荧光的BMSCs 归巢到血管损伤内膜处，而损伤组和对照组均无上述现象，说明BMSCs具有向损伤的血管内膜归巢的能力。经BMSCs移植能抑制损伤血管内膜的异常增生，减轻血管损伤后再狭窄。

当动脉损伤时，内膜细胞增生，管腔丧失代偿性扩张能力，成为血管再狭窄的一个重要原因。Shi等〔8〕的研究发现，血管内膜平滑肌细胞增殖能力增强、合成和分泌细胞外基质增加是导致损伤血管内膜瘢痕形成、弹性回缩的重要因素，平滑肌细胞由正常的收缩表型转化成增殖能力异常提高的合成表型，因此，有效抑制上述过程有助于减轻再狭窄的发生。

研究证实〔9〕，球囊损伤动脉后早期，血管内膜上出现的平滑肌细胞异常增殖，成合成表型，免疫组织化学显示α肌动蛋白(α-actin)表达减弱。在我们的实验中，光镜下观察到移植组新生血管内膜中可见α-SM-actin阳性表达，与损伤组比较明显增强。这是由于球囊损伤后，血管内膜平滑肌细胞发生了表型转化，大多数处于合成表型，增值能力明显提高，而BMSCs移植后，损伤血管内膜平滑肌细胞由收缩表型向合成表型的转化能力下降，合成型平滑肌细胞明显减少，平滑肌细胞异常增值能力受到抑制，血管再狭窄的程度较损伤组明显减轻。

PCNA是一种核蛋白，其相对分子质量为36 000，PCNA在平滑肌细胞增殖过程中合成活跃〔10,11〕，表达呈周期依赖性，其表达能力在G1开始增加，高峰出现在S期，G2、M期开始下降。PCNA是评价平滑肌细胞增殖状态的可靠指标，其表达水平与平滑肌细胞的增殖活跃程度成正比。本研究结果显示，BMSCs移植抑制了平滑肌细胞的增殖，从而减轻动脉再狭窄进程。

综上所述，兔腹主动脉损伤后局部移植BMSCs，能归巢到受损伤的血管内膜处，促进了血管内膜平滑肌细胞向收缩表型的转化，抑制了平滑肌细胞的过度增殖，减轻了血管再狭窄，为动脉粥样硬化及狭窄的防治提供新的途径。

1 DeSantiago J，Bare DJ，Semennov I，etal.Excitation-contraction coupling in ventricular myocytes is enhanced by paracrine signaling from mesenchymal stem cells〔J〕.J Mol Cell Cardiol，2012；52(6)：249-56.

2 Watson T，Goon PK，Lip GY.Endothelial progenitor cells，endothelial dysfunc-tion，inflammation and oxidative stress in hypertension〔J〕.Antioxid Redox Signal，2008；10(8)：1079-88.

3 Pankajakshan D，Kansal V，Agrawal DK.In vitro differentiation of bone marrow derived porcine mesenchymal stem cells to endothelial cells〔J〕.Tissue Eng Regen Med，2012；10(7)：478-83.

4 李 贺，周 欣，舒 瑶，等.骨髓间充质干细胞移植对心肌缺血/再灌注大鼠心肌胶原与血管新生的影响〔J〕.中国动脉硬化杂志，2008；16(4)：813-8.

5 Wu X，Wang C，Tang C，etal.Mesenchymal stem cell seeding promotes reendothelialization of the endovascular stent〔J〕.J Biomed Mater Res A,2011；98(3)：442-9.

6 刘志江，石 蓓，许官学，等.骨髓间充质干细胞移植对兔颈动脉损伤后再狭窄的影响〔J〕.中国动脉硬化杂志，2013；21(1)：22-7.

7 Foteinos G，Hu Y，Xiao Q，etal.Rapid endothelial turnover in atherosclerosis-prone areas coincides with stem cell repair in apolipoprotein E-deficient mice〔J〕.Circulation，2014；17(14)：1856-63.

8 Shi Y，OJ Jr,Mannion JD，etal.Remodeling of autologous saphenous vein grafts.The role of perivascular myofibroblasts〔J〕.Circulation，2011；95(12)：268-9.

9 Hong MK，Mintz GS，Abizaid AS，etal.Intravascular ultrasound assessment of the presence of vascular remodeling in diseased human saphenous vein by passgrafts〔J〕.Am J Cardiol，2009；84(9)：992-8.

10 Branca M，Ciotti M，Giorgi C，etal.Up-regulation of proliferating cell nuclear antigen(PCNA)is closely associated with high-risk human papillomavirus(HPV) and progression of cervical intraepithelial neoplasia(CINI but does not predict disease outcome in cervical cancer)〔J〕.Eur J Obstetrics Gyneco Reprod Biol，2007；130(2)：223-31.

11 Zhang DZ，Zhang TL，Hu CM，etal.PTEN gene transfaction on rabbit inhibition of restenosis experimental research〔J〕.Chin Health Nutr，2012；7(12)：1-2.

〔2015-09-07修回〕

(编辑 曹梦园)

吴向军(1977-)，男，博士，副主任医师，主要从事心脏介入研究。

王庆元(1973-)，男，硕士，副主任医师，主要从事心血管病学诊断与治疗研究。

R541.6

A

1005-9202(2017)04-0814-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.013