Nr4a1拮抗剂抑制肺癌细胞的上皮-间质转化的作用机制

毛小亮 童继春 朱 征 殷亚俊 王烨铭 石亮荣

(常州市第二人民医院胸心外科,江苏 常州 213000)

Nr4a1拮抗剂抑制肺癌细胞的上皮-间质转化的作用机制

毛小亮 童继春 朱 征 殷亚俊 王烨铭 石亮荣1

(常州市第二人民医院胸心外科,江苏 常州 213000)

目的 观察Nr4a1拮抗剂在αVβ6-ERK-ETS1通路中抑制肺癌细胞上皮-间质转化的作用。方法 培养传代肺癌A549细胞系，分为实验组及对照组，两组均采用生长因子诱导上皮-间质转化过程，实验组采用Nr4a1拮抗剂阻断αVβ6-ERK-ETS1通路，对照组不采用拮抗剂，采用流式细胞术及Western印迹检测信号通路中相关蛋白表达水平。结果 形态学上，实验组组细胞呈梭形或类似于成纤维细胞的形态，而对照组部分细胞呈圆形或卵圆形。Western印迹及流式细胞检测均发现对照组细胞上皮细胞标志物E-cadherin、γ-catenin及αvβ6 表达均较处理前显著降低，而间质细胞标记物Nβ-cateinin、Vimentin表达则有不同程度升高(P<0.05)。结论 Nr4a1拮抗剂能够通过αVβ6-ERK-ETS1通路抑制肺癌细胞的上皮-间质转化。

Nr4al拮抗剂；αVβ6-ERK-ETS1通路；上皮-间质转化

上皮-间质转换(EMT)是肿瘤转移主要的机制之一，上皮细胞转换为间质细胞过程中，表面的相关标识蛋白如E-cadherin、Occludin、Z01和Cytokeratin表达逐渐下调，而N-cadherin、Vimentin和Fibronectin等间质细胞标识蛋白表达上调〔1〕。

αVβ6-ERK-ETS1通路是细胞内外信号传导重要通路，参与肿瘤细胞的转移过程，但具体机制尚不明确。Nr4a1是早期反应基因家族中的一员，可以接受细胞外信号，对不同靶基因的转录进行调控。目前，大量体内体外研究证实Nr4a1与各种实体肿瘤的转移也存在密切的关系〔2～4〕。因此，Nr4a1是否通过αVβ6-erk-ets1通路诱发肺癌细胞发生转移尚缺乏研究。本实验通过检测肺癌A549细胞中相关蛋白的表达水平，探讨Nr4a1促进转移的相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料 肺癌A549细胞系，RPMI 1640培养液，αVβ6单克隆抗体，Nr4a1拮抗剂，抗ERK 单抗、E-cadherin抗体、Vimentin抗体、p-ERK抗体、α-catenin抗体、Fat-1抗体、γ-catenin抗体、Nβ-cateinin抗体、P38抗体、JNK抗体、PI3K抗体、AKT抗体等,转录因子活性检测试剂盒、流式细胞仪。

1.2 方法

1.2.1 肺癌A549细胞系的传代及培养 取出存有肺癌A549细胞的冻存管，放于37℃温水中，用镊子夹住轻轻摇动使其迅速融化。1 000～2 000 r/min离心3～5 min，无菌条件下打开冻存管，移去上清液，加入1 ml预热的细胞培养液将细胞吹散开，然后转移至25 cm2培养瓶中。加入4 ml的RPMI 1640培养液及10%的胎牛血清。置于37℃、5%CO2培养24 h后，更换培养液。后加入1 ml消化液，在37℃培养箱中孵育5～8 min后把培养瓶放置在倒置显微镜下观察，发现细胞的胞质回缩、胞间质增大后终止消化。加入5 ml预热至37℃的培养液，反复吹打后，吸取一半的细胞悬液，以1∶2传代接种到新的25 cm2培养瓶中，补足培养液至5～10 ml，加10%～20%的胎牛血清。倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2培养，分别加入制备细胞悬液待用。实验组采用Nr4a1多克隆抗体及生长因子(终浓度是10 ng/ml TGF-β1,25 ng/ml EGF)分别加入培养基中，对照组只加入生长因子。

1.2.2 制备细胞蛋白 将细胞悬液加入15 ml离心管中，2 500 r/min离心5 min。弃上清，加入4 ml PBS并轻轻吹打洗涤，再次2 500 r/min离心5 min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。用枪洗干上清后，加100 μl裂解液(含PMSF)冰上裂解30 min。4℃、12 000 r/min离心5 min，取上清分装于1.5 ml离心管中并置于-20℃备用。

1.2.3 流式细胞术检测 取生长较好的实验组及对照组细胞，胰酶消化，1 ml PBS清洗后移入15 ml BD管中。800 r/min离心5 min，去上清，PBS吹洗，再次离心弃上清，重复2次，用0.1 ml冰PBS重悬，移到1.5 ml EP管中。分别按照1∶100加入1 U上皮标志标志物E-cadherin、γ-catenin抗体和间质标志物Nβ-cateinin、Vimentin单克隆抗体，室温孵育1 h，1 000 r/min离心5 min，去上清，PBS吹洗细胞，再次离心弃上清，重复3次，最后重悬于0.5 ml PBS中。按照1∶100分别加入荧光二抗，移入流式管，锡纸包裹避光，上流式细胞仪测定实验组和对照组肺癌细胞表面上皮标志物和间质标志物的表达情况。

1.2.4 Western印迹检测 分别收集实验组及对照组细胞制备的备用蛋白，制作标准曲线，加入5倍SDS 上样缓冲液至终浓度为1倍。沸水中煮5 min使蛋白变性。上样，电泳4 h，电压为40 V，转膜，脱色后晾干备用。上摇床5%脱脂牛奶封闭1 h，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，室温下孵育1～2 h后，用TBST脱色洗2次，每次10 min；再用TBS洗1次，10 min。重复上述步骤加入二抗，ECL法化学发光，显影，定影。

1.3 统计学方法 采用SPSS16.0软件，两个样本间的比较采用t检验，多个样本及组间比较采用方差分析。

2 结 果

2.1 Nr4a1拮抗剂处理前后肺癌细胞形态学变化 实验组细胞呈梭形或类似于成纤维细胞的形态，而对照组部分细胞呈圆形或卵圆形(图1)。生长因子可以诱导上皮细胞向间质细胞转化。

2.2 Western印迹检测调控EMT过程信号通路中相关蛋白及其磷酸化水平 如图2，对照组(7.2 mmol/L,1.2 mmol/L)较实验组ERK(12.5 mmol/L)及p-ERK(1.6 mmol/L)表达水平显著降低(P<0.05)，而AKT(实验组1.8 mmol/L，对照组1.2 mmol/L)、PI3K(实验组13.2 mmol/L，对照组14.8 mmol/L)及MAPK信号通路中其他分子JNK(实验组8.9 mmol/L，对照组9.0 mmol/L)、p-JNK(实验组3.8 mmol/L，对照组4.0 mmol/L)、p-P38(实验组4.3 mmol/L，对照组4.5 mmol/L)、p-AKT(实验组6.8 mmol/L，对照组6.5 mmol/L)P38、JNK等无显著差异(P>0.05)。内参GAPDH水平为10 mmol/L。

图1 实验组与对照组细胞形态学变化

图2 两组中调控EMT过程信号通路中 相关蛋白及其磷酸化水平

2.3 流式细胞术检测细胞EMT过程重要分子表达差异性 流式细胞仪检测发现，对照组细胞E-cadherin、γ-catenin及αvβ6 均较处理前表达显著降低，而间质细胞标记物Nβ-cateinin、Vimentin表达不同程度升高(P<0.05)。

3 讨 论

目前，EMT与肿瘤侵袭转移的关系已经得到明确，也为肿瘤的治疗提供了新的靶点〔5,6〕。实体肿瘤癌细胞来源于上皮细胞，具有极性，通过各种连接方式紧密黏附在一起，无法自由移动；而间质细胞无极性，可以自由移动。因此，癌细胞侵袭转移时，可以通过重新启动上皮-间质转换“程序”转换为间质细胞，获得具有自由迁移运动能力，释放相关酶，在细胞间穿行，穿越基底膜，进入脉管系统，侵袭到远处组织〔7〕。

整合素是一种连接细胞和细胞外环境的跨膜受体，可以通过跨膜作用将外界刺激相关信息传入细胞。 因此，整合素参与了细胞周期调节、细胞形态变化以及运动等生理作用。而αvβ6是唯一仅存于恶性上皮源性肿瘤表面的整合素，可以作为一种抗恶性上皮性肿瘤的靶目标〔8〕。Ets1是Ets转录因子家族中一类转录因子，能够结合基因上游特异蛋白质，活化后从胞质转位至胞核，特异性识别和结合基因启动子,启动和调控相关基因表达，在肿瘤的侵袭转移、血管生成、增殖凋亡等过程中发挥重要作用〔9〕。胞外信号调控激酶(ERK)是真核生物中广泛存在的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(MAPK)中的一种，通过整合素进入细胞核内，促进多种转录因子磷酸化，增强转录活性。

研究发现αvβ6与ERK2之间存在直接连接，结合位点位于746EAERSKAKWQTGTNPLYRG764，因此肿瘤细胞可以将细胞外信号通过αvβ6-ERK2跨膜载体传递给细胞核内转录因子启动相关基因表达(如Nr4a1基因)〔10〕。Nr4a1是早期反应基因家族中的一员，广泛表达于各种组织，包括胸腺、肌肉、肺、肝等，接受细胞外刺激诱导后可以迅速表达，因细胞类型和刺激信号的不同对不同靶点特异性识别和结合调控相关基因的转录，参与细胞的存活与凋亡、代谢性疾病、血管重塑、类固醇合成、肿瘤发生以及炎性反应等。目前研究证实Nr4a1与肺癌的发生及转移也存在密切的关系〔11〕。本研究中肺癌细胞经过Nr4a1拮抗剂处理后，细胞中αvβ6、ERK2 及p-ERK2蛋白的表达水平一致降低，而对照组中表达水平没有变化，因此本研究中Nr4a1基因通过αvβ6-ERK2通路发挥作用。

至于αvβ6-ERK2通路传递的细胞外信号如何调控核内转录因子并影响下游Nr4a1基因，既往研究证实αvβ6-ERK2通路传递的细胞外信号激活了Ets1转录因子，并进入细胞核内，从而特异性识别相关基因启动子，启动相关基因的表达〔10〕。本研究发现，经Nr4a1拮抗剂处理后，间质表型标志分子的表达减低以及上皮表型标志分子表达升高，表明肺癌A549细胞出现了“间质-上皮转化”的过程，Nr4a1拮抗剂抑制了肺癌A549细胞EMT过程。因此，我们推测当细胞外信号(如机体免疫能力差、化疗耐药、干细胞比例升高等)通过αvβ6-ERK2通路传递到细胞核内，通过Ets1转录因子启动相关基因启动子，诱导Nr4a1快速表达相关蛋白酶，降解细胞外基质，促进肿瘤细胞的侵袭及转移。

1 Nakai A,Kartha S,Sakurai A,etal.A human early response gene homologous to murine nur77 and rat NGFI-B,and related to the nuclear receptor superfamily〔J〕.Mol Endocrinol,1990;4(10):1438-43.

2 Hedrick E,Lee SO,Doddapaneni R,etal.NR4A1 antagonists inhibit beta1-integrin-dependent breast cancer cell migration〔J〕.Mol Cell Biol,2016;36:1383-94.

3 Hanna RN,Cekic C,Sag D,etal.Patrolling monocytes control tumor metastasis to the lung〔J〕.Science,2015;350(6263):985-90.

4 Zhou F,Drabsch Y,Dekker TJ,etal.Nuclear receptor NR4A1 promotes breast cancer invasion and metastasis by activating TGF-beta signalling〔J〕.Nat Commun,2014;5:3388.

5 王海兵,张慧君，苏晋梅，等.肺癌A549细胞上皮-间质转化及其对微小RNA表达的影响〔J〕.中华肿瘤杂志，2011;33(8):590-3.

6 Ko H.Geraniin inhibits TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition and suppresses A549 lung cancer migration,invasion and anoikis resistance〔J〕.Bioorg Med Chem Lett,2015;25(17):3529-34.

7 Shao K,Chen ZY,Gautam S,etal.Posttranslational modification of E-cadherin by core fucosylation regulates Src activation and induces epithelial-mesenchymal transition-like process in lung cancer cells〔J〕.Glycobiology,2016;26(2):142-54.

8 Bates RC.The alphavbeta6 integrin as a novel molecular target for colorectal cancer〔J〕.Future Oncol,2005;1(6):821-8.

9 Yordy JS,Muise-Helmericks RC.Signal transduction and Ets family of transcription factors〔J〕.Oncogene,2000;19(55):6503-13.

10 彭 程，牛正川，王 奔，等.去甲斑蝥素阻断αvβ6-ERK-ETS1信号通路抑制结肠癌细胞上皮-间质转化实验研究〔J〕.中国现代普通外科进展,2014;(17):757-62.

11 Zhou J,Wang J,Zeng Y,etal.Implication of epithelial-mesenchymal transition in IGF1R-induced resistance to EGFR-TKIs in advanced non-small cell lung cancer〔J〕.Oncotarget,2015;6(42):44332-45.

〔2016-04-15修回〕

(编辑 徐 杰)

Inhibition of epithelial mesenchymal transition of lung cancer cells via αVβ6-ERK-ETS1 beta pathway by Nr4a1 antibody

MAO Xiao-Liang,TONG Ji-Chun,ZHU Zheng,etal.

Department of Cardiothoracic Surgery,the Second People's Hospital of Changzhou,Changzhou 213000,Jiangsu,China

Objective To observe the effect of Nr4a1 antibody on the epithelial mesenchymal transition(EMT) of lung cancer cells in the αVβ6-ERK-ETS1 pathway.Methods Human lung cancer cell line A549 was cultured,and then divided into experimental and control groups. Growth factors were used for inducing epithelial mesenchymal transition process in two groups. Nr4a1 polyclonal antibody was added to blockade of αVβ6-ERK-ETS1 pathway in the experimental group while the control group was not. The flow cytometry technique and Western blot were used to detect signal pathway related protein expression,and compared between groups.Results The cells of experimental group were fusiform or similar to the morphology of fiber cells,while the control group cells were round or oval. The epithelial cell markers including E-cadherin,gamma catenin andαVβ6 were decreased significantly in control group cell,and stromal cells labeled compounds Nβ-cateinin,vimentin expression were increased (P<0.05). Conclusions The Nr4a1 polyclonal antibody could inhibit EMT of lung cancer cells by inhibiting the αVβ6-ERK-ETS1 pathway.

Nr4al polyclonal antibody;αVβ6-ERK-ETS1 pathway;Epithelial mesenchymal transition

国家自然科学基金(81171653)

童继春(1965-)，男，主任医师，主要从事胸腔镜研究。

毛小亮(1973-)，男，副主任医师，主要从事胸腔镜研究。

R73

A

1005-9202(2017)04-0809-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.011

1 苏州大学附属第三医院