藤梨根提取物对人胃癌SGC7901细胞增殖抑制的影响

党 辉 牟宗玲 宋 锐 王 涛 关徐涛 高 萍

(河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000)

藤梨根提取物对人胃癌SGC7901细胞增殖抑制的影响

党 辉 牟宗玲1宋 锐1王 涛 关徐涛 高 萍

(河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000)

目的 研究藤梨根提取物对胃癌细胞SGC7901的抑制作用及其机制。方法 用MTT法检测不同剂量的藤梨根提取物对人胃癌细胞SGC7901的增殖抑制作用，并用流式细胞仪分别检测细胞周期以及凋亡程度。结果 在浓度范围25～200 μg/ml范围内，不同浓度的藤梨根提取物对胃癌细胞SGC7901均有抑制作用，且有一定的浓度依赖性。且在藤梨根提取物细胞浓度为53、86以及142 μg/ml作用48 h后SGC7901在S期比例增多，凋亡率明显增加。结论 藤梨根提取物可能通过干预细胞周期和凋亡对胃癌细胞SGC7901增殖起抑制作用，同时与药物浓度有一定的依赖性。

藤梨根提取物；胃癌细胞SGC7901；细胞凋亡；细胞周期

胃癌是目前较常见的消化系统恶性肿瘤之一，治疗仍以手术和化疗为主〔1〕。中医学对于胃癌的认识主要见于“噎膈”、“反胃”、“胃脘痛”、“瘾积”等病的描述中。中药可减轻患者放化疗的不良反应，降低术后的高复发率，同时能够改善患者的生存质量，延长患者的生存期。本课题组前期研究成果发现，藤梨根对胃癌、食管癌、结直肠癌等消化系统恶性肿瘤均有较好的疗效。本文拟观察藤梨根提取物对胃癌细胞SGC7901增殖抑制情况。

1 材料与方法

1.1 药物 将购于河南中医药大学第一附属医院中药房的藤梨根1 kg阴干粉碎备用。取500 g藤梨根加入2 000 ml正丁醇浸泡24 h，加热、回流、过滤后药渣再进行一次提取。将两次所得的提取物合并，给予减压回收至膏状，干燥后研末取20 mg以备用。

1.2 SGC7901细胞株 由郑州大学基础医学院微生物教研室提供。采用浓度为100 ml/L胎牛血清的RPMI1640作为培养基，在温度为37℃且5%CO2饱和湿度的培养箱内进行培育。每隔1 d换液，SGC7901细胞每3 d传代一次，传代时用浓度为2.5 g/L胰酶溶液进行消化，取对数生长期的细胞进行实验。

1.3 试剂与仪器 MTT(Amresco sangon公司)、细胞培养液RPMI1640(美国Invitrogen公司)、0.25%胰蛋白酶(美国HyClone公司)、凋亡试剂盒及周期试剂盒(南京凯基生物公司)、流式细胞仪(美国Bectondickinson公司)、紫外分光光度仪(日本Hitachi,U-2001)、比色仪(芬兰KHB公司)、电子分析天平(Bosch AE 200)等。

1.4 方法

1.4.1 MTT法检测藤梨根提取物对SGC7901的抑制率 将20 mg藤梨根提取物溶解于1 ml二甲基亚砜(DMSO)，备用时稀释。SGC7901接种于96孔板内，每孔内104个细胞/100 ml培养24 h弃去培养液并加入浓度为25、50、100、200、400 μg/ml的藤梨根提取物100 μl。另设对照孔，对照孔中加入培养液100 μl和稀释药物等量的DMSO。每组设有八个复孔，将细胞培养48 h后加入5 mg/ml MTT 15 μl，继续培养4 h后将上清液吸去，另每孔加入DMSO 150 μl，振荡10 min后比色，显微镜下观察结晶完全溶解，选择570 nm于酶标仪上测定吸光度(OD值)，实验分别重复3次。记录结果计算各浓度藤梨根提取物对细胞的抑制率(IR)，计算公式：抑制率(%)=(对照孔OD值-用药孔OD值)/对照孔OD值×100%

1.4.2 流式细胞检测 SGC7901细胞按密度为105/ml接种于培养皿内，经过24 h的培养后加入含有不同浓度藤梨根提取物的RPMI1640培养液，对照组加入RPMI1640培养液以及溶解药物等量的DMSO，培养48 h后回收细胞。将等待进行细胞周期检测的药物进一步处理：将细胞进行常规消化收集，4℃ PBS悬浮细胞，复加入浓度为70%、20℃的乙醇溶液固定24 h后加入RNAase，在37℃水浴加热30 min，加入碘化丙啶进行荧光染色，200目过滤细胞至流式管内。将进行细胞凋亡实验的细胞进行如下处理：细胞培养48 h后，用不含EDTA的胰酶进行消化并收集细胞。同样用4℃ PBS洗涤后进行离心收集，加入Annexin V-FITC，避光10 min加入PI后再次避光5 min并于1 h后上机检测，重复3次。

1.5 统计学分析 应用SPSS17.0软件，实验数据均采用单因素方差分析的两两比较法，IC50计算采用线性回归。

2 结 果

2.1 藤梨根提取物对胃癌细胞SGC7901增殖的抑制作用 不同浓度的藤梨根提取物对胃癌细胞SGC7901均有着不同程度的体外抑制作用，同时也表现为一定程度的剂量依赖性(P<0.05)。应用统计学处理藤梨根提取物的浓度与抑制率之间的线性回归关系，回归分析法得R2=0.966 088，Y=0.003 477x+0.032 16，根据公式最后所得IC50=142.17 μg/ml，见表1。

表1 藤梨根提取物对胃癌细胞 SGC7901增殖抑制作用

与空白对照组相比：1)P<0.05，2)P<0.01

2.2 藤梨根提取物对SGC7901细胞周期的影响 根据公式得IC50=142.17 μg/ml、IC30=86 μg/ml、IC15=53 μg/ml。将此三种浓度分别作为高、中、低三组作用于SGC7901细胞。作用48 h后，三组与对照组相比均表现为G1期减少，S期增加(P<0.01)，见表2。

表2 藤梨根提取物对胃癌细胞SGC7901 细胞周期的影响

与空白对照组比较：1)P<0.01

2.3 藤梨根提取物对胃癌细胞SGC7901诱导凋亡的作用 与细胞周期一样，分别应用高、中、低三种不同浓度藤梨根提取物作用胃癌SGC7901细胞48 h，与对照组〔(4.68±0.54)%〕相比凋亡率〔高、中、低浓度组分别为(11.22±1.57)%、(10.05±1.56)%、(7.70±0.48)%〕明显增加(P<0.01)。

3 讨 论

近年来，临床中充分显示了中医药配合化疗治疗胃癌疗效显著，国内众多医家不懈努力，已经探索出许多中医药治疗胃癌的有效方法，通过辨证论治和辨病专方治疗以及中西医结合治疗缓解临床症状，改善患者生存质量，延长了生存期，彰显了中医药特色，中西医结合个体化治疗将是一个必然的发展方向。藤梨根是猕猴桃科软枣猕猴桃的根部，藤梨根甘、寒、涩。《河北中草药》记载藤梨根：“能清利湿热，利胆退黄同时能够通乳，可以治疗消化不良、乳汁不下、湿热黄疸，也能治疗跌打损伤以及风湿痹症，擅于治疗消化系统恶性肿瘤”。《青岛中草药》记载：“本品性平，味甘、微酸，能入肾经以及阳明经，具有清热解毒、除湿通络的功效。”王秀娟〔2〕以MTT法测得藤梨根单体作为食管癌耐药逆转剂以及通过下调polβ的表达水平，发现藤梨根提取物对食管癌多药耐药逆转倍数为1.66 μg/ml。崔学梯〔3〕用RAE作用于Ec9706/cDDP后，使Ec9706/cDDP细胞对DDP耐药性起到了部分逆转作用，逆转机制主要是与 GST-π基因的表达水平有关。有关藤梨根提取物中抗肿瘤作用的主要成分，由于实验方法不一，所得到的有效成分也不尽相同，曾有人报道主要为三萜类化合物、熊果酸以及多种氨基酸或糖类等〔4〕。目前查阅文献对于藤梨根的提取主要有正丁醇和乙酸乙酯两种方法，但哪种提取方法能够有效地将藤梨根的有效成分提取至今鲜有报道。本实验考虑到制备方法等问题选用藤梨根正丁醇提取物，而且主要含三帖类化合物，可以用于胃癌细胞的体外实验研究。

细胞凋亡是各种生物最重要的一种生命现象。对于细胞凋亡的抑制以及凋亡基因的紊乱是肿瘤发生的重要原因之一，而细胞凋亡与肿瘤的发生、发展以及预后均有密切关系。所以在肿瘤的治疗上应当尽可能诱导其凋亡。本实验结果显示不同浓度的藤梨根提取物对胃癌SGC7901细胞均能有不同程度的抑制作用，同时表现为一定的剂量依赖性，药物浓度越大，抑制率越高。

本研究为了进一步证实藤梨根抑制胃癌细胞的增殖，通过流式细胞技术观察了SGC7901的细胞周期，结果显示藤梨根提取物能显著诱导胃癌细胞SGC7901凋亡，并能调节细胞周期将其阻滞在S期，同时也表现为一定程度的剂量依赖性。故后期我课题组将观察大剂量藤梨根提取物是否有副作用。由于藤梨根具有清热解毒的作用，大剂量使用是否可导致患者脾胃功能失常、服用时间是否与抑制肿瘤有直接相关性等问题均值得我们思考。

对于藤梨根国内学者也做了相关研究。李昊等〔5〕用不同浓度的藤梨根提取物作用胃癌细胞发现其抑制率为88.10%，同样也有一定的浓度和时间依赖性，而其机制可能与直接杀伤或者诱导细胞凋亡有关。卫培峰等〔6〕应用藤梨根提取物作用胃癌细胞48～96 h后发现与对照组相比细胞的凋亡率明显下降，显微镜下观察细胞形态后可发现加入藤梨根提取物后细胞体积明显缩小，细胞核不均匀，凋亡细胞胞体缩小，细胞质内可见颗粒小块，而这些细胞形态均是凋亡细胞的形态学特征。白吉庆〔7〕研究发现藤梨根提取物对胃癌SGC-7901细胞有明显促凋亡作用;藤梨根提取物抑制胃癌SGC-7901细胞 Bcl-2 蛋白水平的表达有可能是促进胃癌 SGC-7901细胞凋亡的作用机制。以上研究并未将实体瘤分为不同证型去研究，由于藤梨根具有清热作用，那么阳虚患者以及实寒证患者是否能使用值得我们下一步深入研究。

1 徐 飚,王建明.胃癌流行病学研究〔J〕中华肿瘤防治杂志,2006;13(1):1-3.

2 王秀娟.藤梨根干预食管癌细胞Ec9706/cDDPpolβ的研究〔D〕.郑州:河南中医学院,2007.

3 崔学梯.藤梨根干预食管癌细胞Ec9706/cDDPGST-π的研究〔D〕.郑州:河南中医学院,2007.

4 杨 帆.藤梨根中化学成分的研究〔D〕.成都：西南交通大学,2004.

5 李 昊,杨慧萍.藤梨根对胃癌细胞抑制作用的实验研究〔J〕.河北中医,2004;26(4):314-5

6 卫培峰,焦晨莉,张三印.藤梨根提取物诱导胃癌细胞凋亡的实验研究〔J〕.陕西中医学院学报,2005;28(5):52.

7 白吉庆.藤梨根提取物对人胃癌SGC-7901细胞凋亡及Bcl-2的影响〔J〕.陕西中医学院学报,2012;35(1):59-61.

〔2016-04-15修回〕

(编辑 李相军)

Effect of Rattan pear root extract on SGC7901 gastric cancer cell growth by intervening cell cycle and inducing apoptosis

DANG Hui,MU Zong-Ling,SONG Rui,etal.

The First Affiliated Hospital,Henan College of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou 450000,Henan,China

Objective To observe the inhibitory effect of Rattan pear root extract on gastric cancer SGC7901 cells and its mechanism. Methods MTT was used to detect different doses of Rattan pear root extract inhibition on proliferation of human gastric cancer SGC7901 cells. Cell cycle and apoptosis were detected.Results In the concentration range from 25 to 200 μg/ml,different concentrations of Rattan pear root extract had inhibitory effect on gastric cancer cells SGC7901 with concentration dependence. Treated with 53,86 μg/ml and 142 μg/ml Rattan pear root extract for 48 h,the SGC7901 in S phase ratio was increased,the apoptosis rate was increased significantly.Conclusions Rattan pear root extract might inhibit gastric cancer SGC7901 cells proliferation by intervening in the cell cycle and apoptosis,at the same time drug concentration has certain dependence.

Rattan pear root extract;Gastric cancer cells SGC7901;Cell apoptosis;Cell cycle

国家自然科学基金资助项目(81301726)；河南省教育厅自然科学基础研究计划(2010A360003)

高 萍(1957-)，女，教授，硕士生导师，主要从事中西医结合恶性肿瘤和血液系统疾病的研究。

党 辉(1981-)，女，硕士，主治医师，主要从事中医药防治恶性肿瘤和血液系统疾病研究。

R73

A

1005-9202(2017)04-0786-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.003

1 山东体育学院