NLRP3与急性心肌梗死患者预后的研究

董元宝+尹丽娟+王英华+李伟真+王小龙

【摘要】 目的 探讨Nod样受体蛋白3（NLRP3）对急性心肌梗死患者预后的预测价值， 为NLRP3的临床应用提供依据。方法 155例因急性心肌梗死入院治疗患者为研究对象， 收集临床资料， 分离外周血单个核细胞， 以免疫印迹法（Western blotting）定量测定NLRP3水平， 测定B型钠尿肽前体（NT-proBNP）及左室射血分数（LVEF）。根据1年随访结果， 将研究对象分为无不良心血管事件（MACE）组（115例）及MACE组（42例）， 观察患者预后与NLRP3表达水平的关系。结果 两组患者的年龄、性别、体质量指数（BMI）、吸烟、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、阿司匹林使用率、氯吡格雷使用率、他汀使用率比較， 差异无统计学意义（P<0.05）。与无MACE组相比， MACE组NLRP3在外周血单个核细胞中的表达显著升高， NT-proBNP水平显著升高；此外LVEF较低， 血管紧张素转化酶抑制剂/血管紧张素受体拮抗剂（ACEI/ARB）及β受体阻断剂使用率较低， 有高血压病史患者比例较低， 而糖尿病病史患者比例较高， 差异有统计学意义（P<0.05）。多因素Logistic回归分析表明， NLRP3 [OR=8.752， 95%CI（2.052， 37.333）， P=0.003]、NT-proBNP [OR=1.020， 95%CI（1.000， 1.043）， P=0.032]、糖尿病史[OR=6.536， 95%CI（2.511， 17.013）， P<0.001]可作为冠心病不良预后的独立预测因子。结论 NLRP3的表达水平与急性心肌梗死患者1年后的临床结果相关， 能够预测急性心肌梗死患者的预后。

【关键词】 Nod样受体蛋白；急性心肌梗死；预后

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.04.002

【Abstract】 Objective To explore the predictive value of pyrin domain-containing 3 （NLRP3） on prognosis of patients with acute myocardial infarction， and to provide basis for clinical application of NLRP3. Methods A total of 155 hospitalized patients due to acute myocardial infarction as study subjects， and their clinical data were collected. Peripheral blood mononuclear cells were separated， and immunoblotting method （Western blotting） was used to quantitative determination of NLRP3 level， as well as detection of N-terminal pro-B type natriuretic peptide （NT-proBNP） and left ventricular ejection fraction （LVEF）. Study subjects were divided by 1 year follow-up outcomes into non major adverse cardiac events （MACE） group （115 cases） and MACE group （42 cases）. Correlation of prognosis and NLRP3 express level was observed. Results There were no statistically significant difference in age， gender， body mass index （BMI）， smoking， low density lipoprotein cholesterol （LDL-C）， utilization rate of aspirin， clopidogrel and statin between two groups. Compared with non MACE group， MACE group had significantly increased expression of NLRP3 in peripheral blood mononuclear cells， as well as significant increase of NT-proBNP levels significantly， lower LVEF score， lower utilization rate of angiotensin converting enzyme inhibitor/angiotensin receptor antagonist （ACEI/ARB） and beta blockers， lower proportion of patients with hypertension history， and higher proportion of patients with diabetes history. Multiple factors Logistic regression analysis showed that NLRP3 [OR=8.752， 95%CI （2.052， 37.333）， P=0.003]， NT-proBNP [OR=1.020， 95%CI （1.000， 1.043）， P=0.032]， diabetes history [OR=6.536， 95%CI （2.511， 17.013）， P<0.001] could be used as an independent predictor of poor prognosis of coronary heart disease. Conclusion Expression level of NLRP3 is correlated to clinical outcome of patients with acute myocardial infarction in 1 year， and it can be able to predict the prognosis of patients with acute myocardial infarction.

【Key words】 Pyrin domain-containing 3； Acute myocardial infarction； Prognosis

目前， NLRP3在动脉粥样硬化疾病发生发展过程中的作用已经被逐步揭示。胆固醇结晶可以通过激活巨噬细胞内的NLRP3炎症小体促进动脉粥样硬化疾病的发生发展[1， 2]。发现NLRP3在人外周血单核细胞中的表达水平与冠状动脉狭窄程度呈显著正相关， 对冠心病有很强的预测意义。目前已有动物实验表明抑制NLRP3炎症小体的活性可减少心肌梗死面积及大鼠血清中肌鈣蛋白I的水平[3]。但NLRP3炎症小体在急性心肌梗死过程及预后的作用， 尚无临床研究。因此， 本研究通过回顾及随访近年来的急性心肌梗死病例资料探讨NLRP3在人外周血单核细胞中的表达水平与急性心肌梗死患者预后的相关性。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 选择2012年1月～2015年6月在潍坊市坊子区人民医院就诊的急性心肌梗死患者155例， 其中男103例，

女52例。排除标准：首诊心肌梗死并院内死亡者， 合并有明确的感染、恶性肿瘤、创伤、风湿病等引起NLRP3水平升高， 以及不方便随访的患者。所有顺利出院的心肌梗死患者通过再入院记录、门诊复诊或电话随访1年， 记录主要MACE， 包括急性冠脉事件（ST段抬高型心肌梗死、非ST段抬高型心肌梗死、不稳定型心绞痛）、新发心力衰竭或原有心力衰竭加重、严重心律失常（心室颤动、室性心动过速）及死亡。以上事件由至2位参与本研究的医师评定。根据随访结果将研究对象分为MACE组（42例）和无MACE组（113例）。

无MACE组， 男75例， 女38例， 年龄（65.45±11.25）岁；MACE组男28例， 女14例， 年龄（69.17±8.69）岁。本研究所有患者均签署知情同意书。

1. 2 人外周血单核细胞的获取 自患者肱静脉抽取新鲜抗凝血6 ml加等量Hanks液混匀稀释加入含有淋巴细胞分离液的离心管中， 离心10 min， 用Hanks液洗2次， 以含10%胎牛血清的RPMI1640培养基悬浮细胞， 在37℃、5%CO2 孵箱中培养48 h后， 以RPMI1640培养基清洗， 取出非黏附细胞， 获得贴壁的单核细胞。

1. 3 NLRP3的检测 应用免疫印迹法（Western blotting）定量分析NLRP3。收集样本1.5ml无菌离心管中， 冰上操作， 配制细胞裂解液， 以Model450型酶联免疫仪（美国BIO-RAD公司）测波长为492 nm的吸收值定量[4， 5]。

1. 4 检测指标及收集资料 所有人选患者于住院治疗次日清晨空腹抽取肘部静脉血4 ml， 离心后抽取上清液置于-80℃冰箱保存， 相关临床指标由本院临床检验科测定。详细记录患者一般临床资料。

1. 5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行数据统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 非正态分布资料采用中位数（四分位数间距）表示， 两组间比较采用t检验或Mann-Whitney检验， 统计BNP时采用秩和检验；计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验；有统计学差异者再行多因素Logistic回归分析NLRP表达水平与心肌梗死患者主要心血管不良事件的发生是否独立相关。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 MACE 1年随访期内， 无一例患者失访， 113例患者未发生MACE， 42例发生MACE。3例死亡， 3例新发心力衰竭， 18例原有心力衰竭加重；21例出现急性缺血事件， 其中2例为ST段抬高型心肌梗死， 17例为不稳定型心绞痛， 4例为非ST段抬高型心肌梗死；1例发生室性心动过速、室性颤动后死亡， 2例再发心肌梗死后死亡。

2. 2 一般临床资料 首先对两组患者进行独立样本t检验， 结果示两组患者的年龄、性别、BMI、吸烟、DLD-C、阿司匹林使用率、氯吡格雷使用率、他汀使用率比较， 差异无统计学意义（P<0.05）。与无MACE组相比， MACE组LVEF较低， 而NT-proBNP则显著升高；ACEI/ARB及β受体阻断剂使用率较低；同时高血压病史患者比例减低， 而糖尿病病史患者比例升高；NLRP3在外周血单个核细胞中的表达显著升高， 差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2. 3 Logistic回归分析 经过独立样本t检验后发现低LVEF值， 高NT-proBNP值， ACEI/ARB及β受体阻断剂使用率低， 糖尿病史和NLRP3高表达是冠心病患者MACE发生的危险因素， 而高血压病史则是减少MACE发生的保护因素。校正上述因素后进行多因素Logistic回归分析表明， NLRP3[OR=8.752， 95%CI （2.052， 37.333）， P=0.003]、NT-proBNP[OR=1.020， 95%CI （1.000， 1.043）， P=0.032]、糖尿病史[OR=6.536， 95%CI （2.511， 17.013）， P<0.001]与冠心病患者MACE发生呈正相关， 可作为冠心病不良预后的独立预测因子。见表2。因此Logistic回归方程为：Logistic（P）=0.032+6.536×糖尿病史+8.752×NLRP3+1.020×NT-proBNP。

3 讨论

冠心病住院患者中以急性冠状动脉综合征最常见， 其病死率、致残率很高， 主要由不稳定斑块破裂继发出血及血栓形成所致。早期发现不稳定斑块是预防和治疗急性冠状动脉综合征的根本所在[6-8]。在本研究中， 发现NLRP3在人外周血单核细胞中的表达水平与冠心病发病以及冠状动脉狭窄程度呈显著正相关， 对冠心病的发生发展具有很强的预测意义， 这在国内外尚属首次。

既往研究提示， NLRP3炎症小体参与了动脉粥样硬化炎症反应的发生。NLRP3炎症小体的下游产物白细胞介素（IL）-1β和IL-18对动脉粥样硬化的促进作用也得到了证明[9-11]。有研究表明， 对心肌梗死过程中炎症反应进行干预可有效改善心肌梗死症状， 减少心肌梗死面积[12-14]。

然而， 至今尚无研究证明NLRP3炎症小体在人急性心肌梗死患者中的作用， 及其表达程度对患者预后的影响[15]。在本研究中， 根据心肌梗死出院患者1年内MACE的发生， 分为MACE组及无MACE组。结果表明低LVEF值， 高NT-proBNP值， ACEI/ARB及β受体阻断剂使用率低， 糖尿病史和NLRP3高表达是冠心病患者MACE发生的危险因素， 而高血压病史则是减少MACE发生的保护因素。多因素Logistic回归分析表明， NLRP3、NT-proBNP、糖尿病史可作为冠心病不良预后的独立预测因子。本研究将为今后预防和治疗冠状动脉病变提供有力的支持， 为预防和治疗冠状动脉病变提供新的途径。

参考文献

[1] Rajam?ki K， Lappalainen J， ??rni K， et al. Cholesterol Crystals Activate the NLRP3 Inflammasome in Human Macrophages： A Novel Link between Cholesterol Metabolism and Inflammation. Plos One， 2012， 5（7）：e11765.

[2] Duewell P， Kono H， Rayner KJ， et al. NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals. Nature， 2010， 464（7293）：1357.

[3] Marchetti C， Chojnacki J， Toldo S， et al. A novel pharmacologic inhibitor of the NLRP3 inflammasome limits myocardial injury after ischemia-reperfusion in the mouse. Journal of Cardiovascular Pharmacology， 2014， 63（4）：316.

[4] Li B， Luo BB， Qin WD， et al. Bidirectional effect of serum amyloid A on plaque stability. International Journal of Cardiology， 2014， 174（1）：179-183.

[5] Zhang XC， Chen JQ， Li B. Salvianolic acid A Suppresses CCL-20 Expression in TNF-alpha -Treated Macrophages and ApoE Deficient Mice. Journal of cardiovascular pharmacology， 2014， 64（4）：318-325.

[6] 賀琼， 桂庆军. NLRP3炎性体与冠心病的相关性研究进展. 现代医药卫生， 2013， 29（17）：2614-2616.

[7] 喻思扬， 王燕， 刘洋， 等. 炎性体在动脉粥样硬化等心血管疾病中的作用及机制. 中国动脉硬化杂志， 2014， 22（12）：1281-1286.

[8] 齐斌， 任威， 李春江， 等. 人心肌细胞中 NLRP3融合蛋白表达的鉴定. 广西医学， 2014（1）：8-9.

[9] Jiang Y， Wang M， Huang K， et al. Oxidized low-density lipoprotein induces secretion of interleukin-1beta by macrophages via reactive oxygen species-dependent NLRP3 inflammasome activation. Biochemical & Biophysical Research Communications， 2012， 425（2）：121-126.

[10] 陈海燕， 谭春燕， 胡厚祥. NLRP3炎症小体在心肌梗死中作用的研究进展. 川北医学院学报， 2015（2）：155-159.

[11] 党万太， 周京国， 谢文光， 等. NLRP3炎性体在痛风性关节炎患者炎症反应中的机制研究. 中国免疫学杂志， 2014， 30（3）： 373-377.

[12] Lugrin J， Parapanov R， Rosenblatt-Velin N， et al. Cutting edge： IL-1alpha is a crucial danger signal triggering acute myocardial inflammation during myocardial infarction. Journal of immunology （Baltimore， Md. ： 1950）， 2015， 194（2）：499-503.

[13] 郭志浩， 王莉娜， 马根山. NLRP3与心血管疾病关联的研究进展. 东南大学学报医学版， 2014， 33（1）：103-107.

[14] 刘文秀， 尹新华. NLRP3炎性体与心血管疾病的研究进展. 国际免疫学杂志， 2014， 37（2）：97-100.

[15] 冯俊灵， 区文超. NLRP3炎性小体与心血管系统疾病的关系. 广东医学， 2016， 37（16）：2495-2497.