肝癌中CpG甲基化与microRNA-34沉默的研究

林 兰，刘继斌

(南通市肿瘤医院，江苏 南通 226361)

肝癌中CpG甲基化与microRNA-34沉默的研究

林 兰，刘继斌

(南通市肿瘤医院，江苏 南通 226361)

目的 探讨肝癌中miR-34家族甲基化的价值。方法 入组经病理组织学确诊的43例原发性肝癌手术病例以及临近癌旁组织，使用甲基化特异性PCR(MSP)方法分析miR-34在肝癌组织和癌旁组织中的甲基化状态，使用逆转录PCR法验证MSP结果。结果 肝癌组织中miR-34a和miR-34b/c甲基化频率启动分别为72.1%和79.1%，均高于癌旁组织(P<0.05)；miR-34a和miR-34b/c在肝癌组织中明显比癌旁组织表达下调(P<0.05)；肝癌组织中miR-34b表达与CpG甲基化呈负相关(P<0.05)。结论 肝癌组织中DNA甲基化可能参与了miR-34b的失活。

微小RNA-34；甲基化；肝癌

原发性肝癌是全球最为常见的恶性肿瘤之一，新发病例居我国所有恶性肿瘤的第4位；死亡病例居全部癌症死亡病例第2位[1]。某些微小RNA(microRNA,miR)的表达异常可促进肝癌的发生。与编码基因相同，miR启动子区域CpG岛甲基化异常，也可以引起miR表达缺失,影响肿瘤恶性表型的发展。本文初步探讨了肝癌中CpG甲基化与miR-34沉默的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 肝癌病例组 收集2010年4月至2011年10月南通市肿瘤医院收治的经病理组织学确诊的43例原发性肝癌手术病例以及临近癌旁组织，无年龄、性别限制，患者的人口统计数据包括性别、年龄、乙型肝炎病毒感染情况、丙型肝炎病毒感染情况、乙型肝炎肝硬化情况、具有完备的流行病学和临床资料(如肿瘤的大小、单个或多发、有无包膜及有无门静脉癌栓、临床分期和Child分级等)、已经随访和采集外周血生物样本；手术前未接受过放疗、生物治疗或抗肿瘤药物化疗。该研究所需标本均经过南通市伦理委员会同意通过。

1.1.2 资料和标本的收集 调查问卷主要包括一般情况、既往史、家族史、临床诊断和治疗情况等。为保证调查和随访资料的质量，课题组统一制订问卷调查和随访工作手册，培训调查和随访人员，统一方法和标准。对所有资料由专人进行编码，并在复核无误后双轨录入计算机。对所有病例定期随访，每3个月一次直至死亡。

每个研究对象均采用真空抗凝采血管采集手术前静脉血5 mL，4 h内离心分别分离血浆、白细胞和红细胞至1.5 mL离心管中(均各保存2份)，-80 ℃冷冻保存备用。同时，手术切除的组织标本离体10 min内取材,经焦碳酸二乙酯处理的冷PBS冲洗后，液氮冷冻保存备用。

1.2 方法

1.2.1 组织DNA和RNA的提取 分别采用QIAamp DNA mini kit、QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit以及Trizol提取冰冻组织血液中DNA和RNA，其DNA和RNA浓度和纯度均经NanoDrop 2000分光光度计检测符合研究需要。

1.2.2 甲基化特异性PCR(MSP) 基因组DNA(1 μg)严格按照EZ DNAMethylation-GoldTMKit甲基化试剂盒说明书操作。甲基化和非甲基化引物使用有关文献报道过的[2-5]。阳性对照采用Qiagen甲基化和非甲基化人类DNA质控品，阴性对照采用蒸馏水。miR-34a扩增程序为[4]：95 ℃ 5 min，95个循环； 2 ℃，20 s；68 ℃，30 s； 72 ℃，30 s； 66 ℃，2个循环和65 ℃，34个循环；最后72 ℃为4 min。miR-34b/c扩增程序为[4]，37 ℃，20 s，95个循环； 61 ℃，30 s和72 ℃，30 s,4 min。PCR产物在质量分数2.5%琼脂糖凝胶和溴化乙锭染色。

1.2.3 定量逆转录PCR(RT-PCR) miR-34a、miR-34b和miR-34c的表达使用定量RT-PCR进行检测。总RNA(1 μg)使用miR特异性茎环逆转录引物和逆转录酶XL进茎环逆转录(RT)。cDNA在进行Real-time PCR前首先用水进行20倍稀释，Real-time PCR 采用Power SYBR Green PCR Master Mix进行扩增。Real-time PCR是在ABI 7900 Real-Time PCR 系统里以一式三份的形式进行操作的。使用小核RNA U6进行了归一化处理[6-7]。相关表达通过公式2-ΔCt计算，ΔCt=ctmirna-ctu6。

1.3 统计学处理 应用EpiData对流行病学资料和实验室数据进行录入和管理，采用SAS软件对数据进行分析，分析方法包括计数资料的χ2检验、非参数检验，单因素和多因素Logistic回归分析，COX回归模型分析等，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 肝癌患者的临床病理特征 43例肝癌患者中，男31例，女12例；中位年龄53岁；乙型肝炎病毒感染者28例，占65.1%；饮酒者13例，占30.2；吸烟者15例，占34.9%。见表1。

2.2 miR-34在肝癌组织和癌旁组织中的甲基化状态 miR-34a启动子在43例肝癌组织中有31例(72.1%)发生了甲基化，高于癌旁组织22例(51.2%)(P=0.046)。79.1%(34/43)的肝癌组织和53.5%(23/43)的癌旁组织显示miR-34b/c启动子发生甲基化(P=0.012)。见图1。

表1 肝癌患者miR-34甲基化与临床病理特征的关系

2.3 miR表达和miR甲基化之间的关系 为了进一步调查在肝癌中是否DNA甲基化沉默了miR-34家族的表达，我们评估了在甲基化和非甲基化组miR-34a、miR-34b和miR-34c表达水平，结果显示，miR-34b表达水平在甲基化组明显低于非甲基化组(P=0.026)。2组miR-34a和miR-34c没有观察到明显变化。见图2。

3 讨论

miR作为一类重要的癌基因和抑癌基因，参与肿瘤维持生长信号、逃避生长抑制、抵抗凋亡、无限复制能力、引起血管生成、激活侵袭和转移、调控能量代谢、逃避免疫摧毁等生物学行为[8]。以肝癌为例，miR-7可以通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制肝癌的生长[9]；miR-26a可以通过调控cMet信号通路抑制肝癌血管生成，影响肝癌患者的预后转归[10]。尽管miR可以靶向调控多个mRNA，发挥其重要生物学功能，但是miR异常表达的调控机制尚不明确。

DNA甲基化和组蛋白修饰也一直是基因表达调控方面的研究热点[11]。已有研究[12]证据提示，miR异常表达可能受到DNA甲基化的影响。miR200b/miR200a/miR-429簇上游4个异常低甲基化的CpG位点可以在肝癌起始细胞和早期肝癌组织中上调miR-429的表达，进而通过一些信号通路促进肝细胞自我更新、恶性分化、化疗抵抗以及致瘤等[13]。

图1 肝癌组织和癌旁组织中miR-34a(A)和miR-34b/c(B)的MSP检测结果

图2 肝癌组织中miR-34b的甲基化状态与表达的关系

miR-34家族是P53的转录目标，气可以抑制肝癌细胞的增殖、转移和侵袭。miR-34家族DNA甲基化改变已经在多种恶性肿瘤中被发现。在我们的研究中，我们首先探讨了肝癌中miR-34家族CpG岛甲基化，并且通过甲基化特异性PCR分析发现miR-34a和miR-34b/c甲基化的频率分别为72.1%和79.1%。异常的DNA甲基化可抑制miR的表达，我们发现在肝癌组织中miR-34家族的表达水平被下调，此结果提示我们在肝癌组织中miR-34家族具有抑制肿瘤的特性。此外，进一步的分析表明，对于本研究的肝癌患者，甲基化的肿瘤组织中miR-34b的表达水平明显低于未甲基化组织，提示我们miR-34b启动子区域CpG岛异常甲基化可能沉默了其的表达。总之，肝癌组织中DNA甲基化可能参与了miR-34b的失活。

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Study on Methylation of MicroRNA-34 in the Hepatocellular Carcinoma

LIN Lan,LIU Jibin

(NantongTumourHospital，Nantong226361,China)

Objective To explore the value of methylation of microRNA-34 (miR-34) family in the hepatocellular carcinoma.Methods Tumor and adjacent non-tumor tissues were collected from 43 hepatocellular carcinoma patients who underwent surgery.Methylation specific PCR (MSP) method was used to analyze the methylation status of miR-34 in the hepatocellular carcinoma tissues and the adjacent non-tumor tissues,and the results were verified by reverse transcription PCR method.Results The methylation frequencies of miR-34a and miR-34b/c were 72.1% and 79.1% in the hepatocellular carcinoma tissues,which were significantly higher than that in the adjacent non-tumor tissues (P<0.05),respectively.The expressions of miR-34a and miR-34b/c were significantly down-regulated in the hepatocellular carcinoma tissues compared with adjacent non-tumor tissues (P<0.05).The expression of miR-34b were negatively related with DNA methylation in the hepatocellular carcinoma tissues.Conclusion DNA methylation may be involved in the inactivation of miR-34b in HCC.

microRNA-34；methylation；hepatocellular carcinoma

中国博士后科学基金资助项目(编号：2013M541563)；江苏省六大人才高峰基金资助项目(编号：wsw-009)

林兰(1968-)，女，副主任技师，主要从事肿瘤免疫学检验以及肿瘤预后研究工作。E-mail :kindrabbit75@163.com

刘继斌(1974-)，男，博士，主任医师，主要从事肿瘤生物治疗相关研究。E-mail :tians2008@163.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2017.01.005

R735.7;R730.23

A

1673-5412(2017)01-0019-04

2016-12-20)