肾上腺皮质腺瘤组织中Calretinin、Melan-A和Inhibin α的表达及意义

侯卫华，李从洋，段尚林，胡学信，刘艳峰

(解放军第152中心医院病理科，河南 平顶山 467000)

肾上腺皮质腺瘤组织中Calretinin、Melan-A和Inhibin α的表达及意义

侯卫华，李从洋，段尚林，胡学信，刘艳峰

(解放军第152中心医院病理科，河南 平顶山 467000)

目的 探讨Calretinin、Melan-A和Inhibin α在肾上腺皮质腺瘤(ACA)组织中的表达及意义。方法 采用免疫组化MaxVision两步法检测30例ACA、4例肾上腺皮质结节状增生、30例肾上腺良性嗜铬细胞瘤(ABP)、8例正常肾上腺组织中Calretinin、Melan-A和Inhibin α的表达。结果 Calretinin阳性率：ACA 70.0%、肾上腺皮质结节状增生100.0%、ABP 13.4%、正常肾上腺皮质75.0%、正常肾上腺髓质0.0%；Melan-A阳性率：ACA 53.3%、肾上腺皮质结节状增生50.0%、ABP 3.3%、正常肾上腺皮质25.0%、正常肾上腺髓质0.0%；Inhibin α阳性率：ACA 83.3%、肾上腺皮质结节状增生100.0%、ABP 6.7%、正常肾上腺皮质100.0%、正常肾上腺髓质0.0%。Calretinin、Melan-A和Inhibin α在ACA组织中的表达显著高于ABP，差异有统计学意义(0.05)。三者或两两联合检测敏感性最高的是Calretinin与Inhibin α(76.7%)、特异性最高的是Melan-A与Inhibin α(95.0%)、准确性最高的是Calretinin与Inhibin α(83.3%)。结论 Calretinin、Melan-A和Inhibin α联合检测在ACA的诊断及其与ABP的鉴别诊断中具有重要价值。

肾上腺皮质腺瘤；肾上腺良性嗜铬细胞瘤；Calretinin；Melan-A；Inhibin α

肾上腺肿瘤按照组织起源可分为皮质肿瘤和髓质肿瘤，肾上腺皮质腺瘤(adrenal cortical adenoma，ACA)是来源于肾上腺皮质细胞的良性上皮性肿瘤，发病率高，其临床表现取决于肿瘤的激素分泌状态，并据此分为产生皮质醇的腺瘤、产生醛固酮的腺瘤、分泌雄激素和雌激素的腺瘤以及无能性肾上腺皮质腺瘤，临床通常依据临床表现及相关激素水平检测来确定肿瘤类型，但部分ACA是影像学体检偶然间发现的无功能性肾上腺肿块。该病的病变特点是瘤细胞的细胞质内含有丰富的脂质，形成巢、索状并伴丰富的血管和窦隙样结构。肾上腺良性嗜铬细胞瘤(adrenal benign phaeochromocytoma，ABP)是肾上腺髓质起源的最常见良性肿瘤，瘤组织形态结构与ACA有很多相似之处，尤其是当瘤细胞发生脂质变性时，呈透明细胞外观，貌似ACA，常给鉴别诊断带来一定困难。传统的组织化学技术包括嗜铬反应和银染都不是特异性的，多已弃用。近年来随着免疫组化的广泛开展，用于肾上腺肿瘤的免疫标记种类繁多，本研究旨在通过检测肾上腺皮、髓质组织中Calretinin、Melan-A和Inhibin α的表达，探讨其在原发性ACA诊断及其与ABP的鉴别诊断中的价值。

1 材料与方法

1.1 一般资料 收集2003年1月至2015年6月解放军第152中心医院病理科肾上腺手术存档标本72例，其中30例ACA、肾上腺皮质结节状增生4例、ABP 30例、正常肾上腺8例(4例来自成人肾癌根治切除标本之肾上腺，4例来自胎儿尸检标本之肾上腺)。30例ACA中，伴Cushing综合征9例，伴Conn综合征17例，无功能者4例；年龄10～70岁，平均年龄48岁；男11例，女19，男女比例为11.8；肿瘤最大直径1～10 cm，平均3.8 cm。

1.2 免疫组化法检测Calretinin、Melan-A和Inhibin α蛋白表达 所有标本均经体积分数10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，3 μm厚连续切片，免疫组化采用MaxVision两步法，操作步骤按说明书进行。使用已知阳性切片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照，对照切片与研究标本在同一条件下进行染色。结果判定：Calretinin(多克隆)、Melan-A(A103)和Inhibin α(R1)均表达于细胞质。染色阳性是指细胞质呈浅黄色至棕褐色。综合判断高倍镜下阳性细胞百分率评分和染色强度评分。按染色强度评分：无染色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。按阳性细胞百分率评分：高倍镜下随机选取5个视野阳性细胞数之平均数为该例阳性细胞数结果，≤5%为0分，>5%～25%为1分，>25%～50%为2分，>50%～75%为3分，>75%为4分。染色强度得分和阳性细胞百分率得分相加，0分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为中等阳性(++)，6～7分为强阳性(+++)，后三者均按阳性计数。

1.3 统计学处理 采用SPSS 20.0对实验数据进行统计分析，计数资料采用频率或百分数表示，并采用Fisher确切概率法进行比较；按照临床流行病学诊断试验研究评价计算方法，对不同免疫标志物单独检测和联合检测时的敏感性、特异性和准确性进行计算和比较，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 Calretinin、Melan-A和Inhibin α在不同肾上腺组织中的表达 Calretinin阳性率：ACA 70.0%、肾上腺皮质结节状增生100.0%、ABP 13.4%、正常肾上腺皮质75.0%、正常肾上腺髓质0.0%；Melan-A阳性率：ACA 53.3%、肾上腺皮质结节状增生50.0%、ABP 3.3%、正常肾上腺皮质25.0%、正常肾上腺髓质0.0%；Inhibin α阳性率：ACA 83.3%、肾上腺皮质结节状增生100.0%、ABP 6.7%、正常肾上腺皮质100.0%、正常肾上腺髓质0.0%。Calretinin、Melan-A和Inhibin α在ACA组织中的表达显著高于ABP，差异有统计学意义(P<0.05)。ACA组织中Calretinin、Melan-A和Inhibin α的阳性表达与患者的年龄、性别、直径及有无产激素功能无关(P>0.05)。见表1、2。

2.2 不同免疫标志物检测的临床诊断价值 Calretinin、Melan-A和Inhibin α单独用于ACA和ABP的鉴别诊断时敏感性最高的是Inhibin α(83.3%)、特异性最高的是Melan-A(96.7%)、准确性最高的是Inhibin α(88.3%)。三者或两两联合检测敏感性最高的是Calretinin与Inhibin α(76.7%)、特异性最高的是Melan-A与Inhibin α(95.0%)、准确性最高的是Calretinin与Inhibin α(83.3%)。见表3。

3 讨论

Calretinin是一种细胞内钙结合蛋白，属于激动蛋白C超家族，该类蛋白的特征是具有EF手形结构。一般用于标记神经、间皮及卵巢性索间质的肿瘤，文献报道肾上腺皮质肿瘤也可表达Calretinin[1]。我们检测了ACA、ABP、肾上腺皮质结节状增生及正常(成人及胎儿)肾上腺皮、髓质中Calretinin多克隆抗体的表达情况，结果显示，Calretinin在ACA、结节状增生和正常肾上腺皮质中阳性率明显增高，其中在ACA中阳性率为70.0%，以中等至强阳性为主，而30例ABP中仅4例弱阳性表达。与Jorda等[2]报道的较为一致。Zhang等[3]的研究结果显示Calretinin在ACC组织中阳性率更高，ACA组织中阳性率为96%，肾上腺皮质腺癌组织中阳性率为92%，而20例嗜铬细胞瘤无一例阳性。因此，可以认为免疫染色中等强度以上的阳性表达对ACA有很好的提示意义。同时研究表明Calretinin表达与患者年龄、性别、肿瘤大小及ACA功能状态无关。

表1 Calretinin、Melan-A和Inhibin α在不同肾上腺组织中的表达

注：ABP与ACA之间免疫标志物阳性率比较：Calretinin：χ2=19.817，P<0.001；Melan-A：χ2=18.468，P<0.001；Inhibin α：χ2=35.623，P<0.001

表2 Calretinin、Melan-A和Inhibin α的表达与ACA临床病理特征的关系

表3 Calretinin、Melan-A和Inhibin α及其联合检测在ACA和ABP鉴别诊断中应用价值 %(n/n)

Melan-A亦称T细胞1识别的黑色素瘤抗原，是从黑色素瘤细胞系中克隆而来的，共培育出2种单克隆抗体，克隆号为A103和M2-7C10，Melan-A主要用于恶性黑色素瘤和伴有黑色素细胞分化的肿瘤的诊断和鉴别诊断，此外还常用于具有血管周上皮样细胞分化的肿瘤和产类固醇激素的肿瘤，如Leydig细胞瘤、粒层细胞瘤的鉴别诊断。Busam等[4]报道了该抗体可与类固醇生成细胞上的抗原决定簇交叉反应，其中在肾上腺皮质和性腺A103呈阳性反应，该研究显示，A103表达于100.0%的肾上腺皮质肿瘤，而嗜铬细胞瘤和其他上皮性肿瘤均不表达。Loy等[5]对A103在肾上腺皮质肿瘤鉴别诊断中的作用进行了广泛研究，结果发现，21例肾上腺皮质肿瘤均呈阳性(100.0%)，所有的转移癌和嗜铬细胞瘤均为阴性。而其他研究没能达到100.0%的阳性率[4,6]。本研究结果显示，Melan-A在ACA中阳性率仅为53.3%，但与在ABP中阳性率3.3%比较差异仍有统计学意义，且Melan-A特异性高达96.7%，可见Melan-A在ACA和ABP的鉴别诊断中仍具有较高实用价值。Melan-A另一种单克隆抗体M2-7C10在肾上腺皮质肿瘤中为阴性[4]，而且Coulie等[7]运用PCR技术在肾上腺皮质中未检测出Melan-A的mRNA。这些发现提示A103在肾上腺皮质及皮质肿瘤中的阳性反应仅是一种交叉反应，系非特异性染色，正是这种相对恒定的交叉反应使其可用于诊断肾上腺皮质肿瘤。此外，Melan-A表达与临床病理特征间亦无相关性。

Inhibin α是一种二聚体蛋白质激素，是转化生长因子β超家族中的成员，Inhibin α亚单位仅一种分子结构，相对分子质量为18 000，位于人染色体2q33。由睾丸的Sertoli细胞和卵巢粒层细胞产生，能抑制垂体促性腺激素的产生和分泌。在许多性索-间质肿瘤中表达，常用于卵巢颗粒细胞瘤和癌的鉴别诊断。近来研究[8-10]发现Inhibin α在正常肾上腺皮质、皮质结状增生及皮质肿瘤中均表达，并在肾上腺皮质中检测出Inhibin α的mRNA。本次研究显示Inhibin α在肾上腺皮质结节增生及正常腺上腺皮质中阳性率均为100.0%，据我们观察Inhibin α在正常肾上腺皮质的表达以网状带和束状带内侧为主，球状带及束状带外侧基本为阴性。在ACA中阳性率为83.3%，以中等强度为主，与Calretinin、Melan-A相比更为敏感，而在ABP中阳性率仅为6.7%，在正常肾上腺髓质中均阴性，与国外文献[6,11]新近报道的结果较为接近。Inhibin α在肾上腺皮质肿瘤中的表达与其功能状态关系的研究结果报道不一，多认为在伴有男性化和Cushing综合征时表达最强，而伴发Conn综合征与无功能者表达相对较低[10,12]。我们的研究显示Inhibin α与患者年龄、性别、肿瘤大小以及ACA功能状态无关，这与McCluggage等[13]的研究结果一致。此外，有研究显示Inhibin基因R337H TP53突变可导致巴西人及其他某些种族人群肾上腺皮质肿瘤的低外显率分子缺陷。对46例巴西肾皮腺皮质肿瘤患儿进行研究，检测其Inhibin基因的遗传改变。结果这些患者中有39例是携带有Inhibin基因R337H TP53突变的杂合子[14]。表明该突变可能性儿童发生肾上腺皮质肿瘤的因素之一。

综上所述，Calretinin、Melan-A和Inhibin α在ACA中以细胞质中等强度表达，具有较高敏感性、特异性及准确性。当遇见不典型病例或鉴别诊断有困难时，联合检测上述指标，具有重要参考价值，有助于提高正确诊断率。

[2]JORDA M,DE MB,NADJI M.Calretinin and inhibin are useful in separating adrenocortical neoplasms from pheochromocytomas[J].Appl Immunohistochem Mol Morphol,2002，10(1):67-70.

[3]ZHANG PJ,GENEGA EM,TOMASZEWSKI JE,et al.The role of calretinin,inhibin,melan-A,BCL-2,and C-kit in differentiating adrenal cortical and medullary tumors: an immunohistochemical study[J].Mod Pathol,2003,16(6):591-597.

[4]BUSAM KJ,IVERSEN K,COPLAN KA,et al.Immunoreactivity for A103,an antibody to melan-A (Mart-1),in adrenocortical and other steroid tumors[J].Am J Surg Pathol,1998,22(1):57-63.

[5]LOY TS,PHILLIPS RW,LINDER CL.A103 immunostaining in the diagnosis of adrenal cortical tumors: an immunohistochemical study of 316 cases[J].Arch Pathol Lab Med,2002，126(2):170-172.

[7]COULIE PG,BRICHARD V,VAN PEL A,et al.A new gene coding for a differentiation antigen recognized by autologous cytolytic T lymphocytes on HLA-A2 melanomas[J].J Exp Med,1994,180(1):35-42.

[8]AROLA J,LIU J,HEIKKILP,et al.Expression of inhibin alpha in the human adrenal gland and adrenocortical tumors[J].Endocr Res,1998,24(3/4):865-867.

[9]HOFLAND J,FEELDERS RA,VAN DER WAL R,et al.Serum inhibin pro-αC is a tumor marker for adrenocortical carcinomas[J].Eur J Endocrinol,2012，166(2):281-289.

[10]DE JONG MK,TEN ASBROEK EE,SLEIDERINK AJ,et al.Gonadectomy-related adrenocortical tumors in ferrets demonstrate increased expression of androgen andestrogen synthesizing enzymes together with high inhibin expression[J].Domest Anim Endocrinol,2014,48:42-47.

[11]ELMONEIM HM,SAMAKA RM,ALI H.Diagnostic role of inhibin α-subunit and inhibin/activin β-subunit in adrenal cortical and medullary tumors in Egyptian patients[J].Appl Immunohistochem Mol Morphol,2012，20(5):462-469.

[12]CHO EY,AHN GH.Immunoexpression of inhibin alpha-subunit in adrenal neoplasms[J].Appl Immunohistochem Mol Morphol,2001,9(3):222-228.

[13]MCCLUGGAGE WG,BURTON J,MAXWELL P,et al.Immunohistochemical staining of normal,hyperplastic,and neoplastic adrenal cortex with a monoclonal antibody against alpha inhibin[J].J Clin Pathol，1998，51(2):114-116.

[14]LONGUI CA,LEMOS-MARINI SH,FIGUEIREDO B,et al.Inhibin alpha-subunit (INHA) gene and locus changes in paediatric adrenocortical tumours from TP53 R337H mutation heterozygote carriers[J].J Med Genet,2004,41(5):354-359.

Expressions and Significance of Calretinin,Melan-A and Inhibin α in the Adrenal Cortical Adenoma

HOU Weihua,LI Congyang,DUAN Shanglin,HU Xuexin,LIU Yanfeng

(DepartmentofPathology,the152thHospitalofPLA,Pingdingshan467000,China)

Objective To explore the expressions and significance of Calretinin,Melan-A and Inhibin α in the adrenal cortical adenoma (ACA).Methods The expressions of Calretinin,Melan-A and Inhibin α in 30 cases of ACA,4 cases of adrenal nodular hyperplasia,30 cases of adrenal benign phaeochromocytoma (ABP) and 8 cases of normal adrenal detected by immunohistochemical MaxVision method.Results Calretinin was positive in the 70.0% of ACA,100.0% of adrenal nodular hyperplasia,13.4% of ABP,75.0% of normal adrenal cortical and 0.0% of normal adrenal medulla; Melan-A was positive in the 53.3% of ACA,50.0% of adrenal nodular hyperplasia,3.3% of ABP,25.0% of normal adrenal cortical and 0.0% of normal adrenal medulla; Inhibin α was positive in the 83.3% of ACA,100.0% of adrenal nodular hyperplasia,6.7% of ABP,100.0% of normal adrenal cortical and 0.0% of normal adrenal medulla.The positive expression rate of Calretinin,Melan-A and Inhibin α protein in the ACA was significantly higher than that in the ABP,the difference was statistically significant (P<0.05).Of combined detection of three or two of them,the sensitivity was highest in the Calretinin and Inhibin α (76.7%),the specificity was highest in the Melan-A and Inhibin α (95.0%),the accuracy was highest in the Calretinin and Inhibin α (83.3%).Conclusion The combined detection of Calretinin,Melan-A and Inhibin α has the important practical value in the diagnosis of ACA and the differential diagnosis of ACA and ABP.

adrenal cortical adenoma; adrenal benign phaeochromocytoma; Calretinin; Melan-A; Inhibin α

侯卫华(1979-)，男，主治医师，主要从事肿瘤病理研究。E-mail：hou.wh@163.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2017.01.004

R736.6;R730.23

A

1673-5412(2017)01-0015-05

2016-03-13)