shRNA干扰COPS3基因对人成骨肉瘤细胞的影响*

陈 军，金雪荣，王 翔，杨 静，曹 卓，苏海川∆

1．第四军医大学唐都医院骨科(西安710038),2．第四军医大学唐都医院肿瘤科(西安 710038)

shRNA干扰COPS3基因对人成骨肉瘤细胞的影响*

陈 军1，金雪荣2，王 翔2，杨 静2，曹 卓2，苏海川2∆

1．第四军医大学唐都医院骨科(西安710038),2．第四军医大学唐都医院肿瘤科(西安 710038)

目的：探究shRNA干扰COPS3基因对人成骨肉瘤细胞基因水平、蛋白水平、增殖能力等方面的影响。方法：选择人成骨肉瘤Saos-2细胞，感染pLKO.1-COPS3 shRNA病毒质粒作为Saos-2 siCOPS3细胞(实验组)，感染pLKO.1-TRC control病毒质粒作为Saos-2 CON细胞(对照组)，感染成功后进行细胞培养，收集细胞用RT-PCR测定COPS3基因mRNA表达量，Western blot检测蛋白表达水平，MMT测定细胞增殖能力，对裸鼠接种细胞悬液进行裸鼠成瘤试验。结果：Saos-2 siCOPS3细胞中，COPS3基因mRNA表达水平与对照组相比下降(P<0.05)，蛋白表达水平、细胞增殖能力与对照组相比下降(P<0.05)，干扰COPS3基因与对照组相比抑制肿瘤体积、重量增加(P<0.05)。结论：COPS3调控骨肉瘤细胞的增殖与骨肉瘤的发生、发展密切相关。

骨肉瘤(Osteosarcoma) 是一种起源于间叶组织的恶性肿瘤，以能产生骨样组织的梭形基质细胞为特征，又称成骨肉瘤，占原发恶性骨肿瘤的20% ，是青少年最常见的原发恶性骨肿瘤，70%～80% 的患者发病年龄在1～25 岁，年发病率约为( 1～3) /100 万人[1]，并且骨肉瘤的转移率较高，其恶性生物学行为使患者病死率居高不下[2]。近期研究发现一个与肿瘤发生发展、转移有关的基因，名为构成型光形态建成同源亚基3(COPS3)，是构成型光形态建成9(COP9)的第3亚单位，位于人类与恶性肿瘤发生有关联的常见扩增区域17P11.2上[3]。COPS3基因已被发现与多种恶性肿瘤的发生发展有关联。本研究旨在探究慢病毒感染后COPS3基因在及人成骨肉瘤细胞(Saos-2)中的表达情况，探讨细胞水平抑制COPS3表达对肿瘤细胞作用，最后在体内验证其抑制肿瘤发生的效果，以期了解COPS3基因与骨肉瘤发生的相互关系。

材料与方法

1 试剂及仪器 人成骨肉瘤Saos-2细胞来自上海细胞库，DMEM高糖培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；Lipotinfectim 3000、Trizol购自美国Invitrogen公司，Polybrene购自上海昕毓科技有限公司， M-MLV 逆转录酶、M1705、dNTPs、Rnase Inhibitor购自美国Promega公司，Oligod T购自上海生工生物工程股份有限公司，SYBR Master Mixture 、购自美国TAKARA公司，RIPA裂解液、DMSO购自德国Millipore公司，胰蛋白酶抑制、剂嘌呤霉素购自美国Thermo公司，小鼠抗人COPS3抗体购自Abnova公司，羊抗小鼠二抗、MTT购自美国Sigma公司。

2 慢病毒包装、感染及细胞培养 构建针对COPS3的3个不同靶点RNAi及其对照重组质粒，经 Wetern blot鉴定的正向序列为5’-CCG GAA CAG TGT CCG ACA GCT CTC ACT CGA GTG AGA GCT GTC GGA CAC TGT TTT TTT G -3’，反向序列为5’-AAT TCA AAA AAA CAG TGT CCG ACA GCT CTC ACT CGA GTG AGA GCT GTC GGA CAC TGT T-3’的质粒可有效降低COPS3的表达。采用三质粒包装系统进行慢病毒包装，常规培养293T细胞，细胞融合率达90%时，用脂质体Lipotinfectim3000将病毒质粒pLKO.1-COPS3 shRNA或对照pLKO.1-TRC control和辅助质粒psPAX2、pMD2.G转入293T细胞，培养48h后收集病毒液。培养Saos-2细胞(15%胎牛血清DMEM)，感染前1d以0.3×106/孔接种于6孔板，细胞融合率达20%～30%时进行细胞感染(病毒液∶培养液=1∶5)。感染pLKO.1-COPS3 shRNA病毒质粒的细胞作为Saos-2 siCOPS3细胞(实验组)，感染pLKO.1-TRC control病毒质粒的细胞作为Saos-2 CON细胞(对照组)，两组细胞加入终浓度为10 μg/ml的Polybrene培养8 h，更换培养液培养72 h，观察细胞荧光率，用4μg/ml嘌呤霉素筛选2周。

3 Western blot检测Saos2细胞中COPS3蛋白表达情况 收集并裂解Saos-2 CON及Saos-2 siCOPS3细胞。样品以12% SDS-PAGE进行电泳(Bio-rad，美国)，200mA恒流转膜1 h，5%脱脂奶粉封闭1h，用封闭液按1∶1000比例稀释小鼠抗人COPS3抗体，4℃孵育过夜，TBST以1∶5000稀释羊抗鼠HRP标记二抗，室温孵育1h，之后进行ECL化学发光。

4 Real-time PCR检测COPS3基因mRNA表达情况 合成COPS3及内参GAPDH引物(上海吉凯基因公司)，COPS3上游引物5’-CGCTATTCTCACAGGTTCAG-3’下游引物5’-GCATCATAGGCTCCATTCTC-3’， 307bp；内参基因GAPDH引物上游引物5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，下游引物5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’， 121bp。收集对数期细胞，Triozl法提取细胞总RNA，根据Promega公司M-MLV操作说明书进行反转录合成cDNA，加入2.0μg Total RNA到反应体系中，反应条件37℃ 5min，42℃1 h，70℃10min，cDNA合成后保存于-20℃。反应体系见表1。

表1 cDNA合成反应体系

用RT-PCR仪(Takara，美国)检测COPS-3基因表达，反应条件：95℃5s，60℃30s，45个循环，反应体系见表2。

表2 RT-PCR反应体系

5 MMT检测Saos-2 siCOPS3细胞增殖能力 分别将Saos-2 siCOPS3组及Saos-2 CON组细胞以2000个/孔接种至96孔板，每组设5个副孔，细胞贴壁后加入20 μl 5mg/ml MTT溶液，37 ℃孵育 4 h后弃去MTT及培养液，每孔加入150 μl二甲基亚砜低速震荡10 min，用TECAN Nano Quant分光光度计测定490 nm吸光值(OD490)，连续6d，以时间为横轴吸光值为纵轴绘制细胞生长曲线。

6 裸鼠成瘤实验 选取6只4～6周雌性BABL/C裸鼠(第四军医大学动物房)，随机分为Saos-2 CON组(n=3)，Saos-2 siCOPS3组(n=3)。消化Saos-2 CON及Saos-2 siCOPS3细胞，1000r /min离心5 min，PBS洗涤2次，用PBS 重悬细胞，血球计数板计数，将两组细胞分别稀释成相同浓度的细胞悬液，以2×106/只对应接种于裸鼠右背部皮下，每3天观察1次肿瘤形成情况，连续4周后处死裸鼠测量肿瘤大小。裸鼠在标准无菌条件下饲养。

7 统计学方法 采用SPSS 19. 0 统计学软件，计量资料采用t检验，当P<0.05 时，认为差异有统计学意义。

结 果

1 Saos-2 siCOPS3细胞siCOPS3基因mRNA及蛋白水平表达变化 由图1 可见，Saos-2 siCOPS3细胞中，COPS3基因mRNA表达水平与对照组相比下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。由图2 可见， Saos-2 siCOPS3组细胞中COPS3基因相关蛋白表达的条带明显比对照组细，其 COPS3基因蛋白表达水平与对照组相比下降。

Saos-2 siCOPS3：感染pLKO.1-COPS3 shRNA病毒质粒的人成骨肉瘤细胞；Saos-2 CON：感染pLKO.1-TRC control(对照)病毒质粒的人成骨肉瘤细胞;*表示P<0.05

图1 Saos-2细胞中COPS3基因mRNA相对表达量

图2 Saos-2细胞中COPS3相关蛋白表达情况

2 Saos-2细胞增殖能力比较 由图3 可见，Saos-2 siCOPS3细胞增殖能力从培养1 d开始低于对照组，并在连续测定的5 d中，增殖能力均小于对照组(P均<0.05)。

图3 Saos-2细胞增殖能力变化

3 裸鼠成瘤情况观察 由图4、图5可见，在饲养期内，小鼠背部肿瘤体积及重量的变化，接种Saos-2 siCOPS3细胞液的小鼠肿瘤体积、重量明显小于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

*表示P<0.05

*表示P<0.01

讨 论

在儿童和青少年中，骨肉瘤的发生严重威胁着他们的健康和生命。骨肉瘤早期发生时一般无典型临床症状，仅有局部疼痛和肿胀，对于正处生长发育期的儿童及青少年来说，其表现容易与生长痛或者外伤混淆，耽误诊疗时机，并且骨肉瘤这种原发性癌症恶性程度较高。目前临床上骨肉瘤的治疗方法仍以化疗和手术为主，由于耐药性和肺转移发生，使骨肉瘤的治疗难度进一步增加，常规手段的疗效并不理想，治疗失败的情况常存在。所以研发新的治疗策略对于提高患者生活质量以及预后具有意义重大。

近年来，随着基因治疗的概念提出，越来越多的医务工作者尝试从基因治疗的角度上，探究从基因水平抑制骨肉瘤的发生及转移，为治疗骨肉瘤提供新的思路。COPS3基因是一种蛋白激酶，能够分解p53蛋白，使下游基因发生改变，从而引起基因组的突变，骨肉瘤组织中常伴有COPS3基因的高表达，它在骨肉瘤的发生中以原癌基因的形式发挥作用[4]。有研究指出，在大约50%的高度恶性骨肿瘤样本中可以检测到COPS3的扩增和过表达[5]，并且在骨肉瘤细胞中，COPS3扩增之后过表达会提高肿瘤细胞的增殖能力从而导致肿瘤体积的增加[6]，最终会使患者病情恶化。由于COPS3与骨肉瘤发生的密切关系，现在越来越多研究认为可以将其作为骨肉瘤治疗的靶基因[7]。

唐彪等[8]在原发性肝癌的相关研究中指出，COPS3在肝癌组织中表达水平和定位均发生改变，可能参与了肝癌的发生和发展过程。孔庆彧等[9]肺癌细胞中以慢病毒为载体，构建了COPS3的干扰体系，发现通过干扰COPS3基因表达，癌细胞增殖能力受到明显抑制，认为COPS3在肺癌发生发展中可能起到重要的作用。本研究结果与前人研究结果一致，在基因水平上可见，构建慢病毒载体感染人成骨肉瘤(Saos-2)细胞抑制COPS3基因，可以降低COPS3基因mRNA表达(P<0.05)，并且在蛋白水平上降低其相关蛋白质表达。汤国庆等[10]在研究基因的表达对骨肉瘤细胞系增殖和迁移能力的影响时认为，带有慢病毒载体的COPS3可以特异性抑制骨肉瘤细胞系中COPS3的表达，显著降低骨肉瘤细胞的增殖和迁移能力。在本研究中，从MMT试验中可见，抑制COPS3基因表达可以降低Saos-2细胞增殖能力。曹鹤等[11]人在研究干扰COPS3基因对肺癌细胞的影响时认为，抑制COPS3基因时裸小鼠体内成瘤体积和质量显著减小。本研究通过裸鼠成瘤实验，在体验证了抑制COPS3基因表达可以明显的抑制肿瘤的体积及重量增加，与前人研究结果一致。研究结果提示，COPS3调控骨肉瘤细胞的增殖，与骨肉瘤的发生、发展密切相关。

综上所述，本研究结果验证构建慢病毒载体(shRNA)感染人成骨肉瘤(Saos-2)细胞抑制COPS3基因，可以降低COPS3基因mRNA表达，降低其相关蛋白质表达，降低骨肉瘤细胞增殖能力，抑制肿瘤的体积及重量增加,为进一步探讨COPS3调控骨肉瘤的发生及发展的机制提供依据。

[1] 燕太强, 梁伟民, 郭 卫. 骨肉瘤的诊疗和研究进展[J]. 中华临床医师杂志:电子版, 2012, 6(17):4988-4990.

[2] 李 勇, 秦 静, 刘宗智. Survivin-shRNA对骨肉瘤MG-63细胞增殖、凋亡影响相关研究[J]. 陕西医学杂志, 2015, 44(9):1118-1120.

[3] Both J, Wu T, Bras J,etal. Identification of novel candidate oncogenes in chromosome rgion 17p11.2-p12 in human osteosarcoma[J]. Plos One, 2012, 7(1):1492-1492.

[4] Whittaker S, Marais R, Zhu AX. The role of signaling path ways in the development and treatment of hepatocellular carcinoma[J]. Oncogene, 2010, 29(36): 4989-5005.

[5] 苏海川, 陈 军, 赵玉红,等. COPS3基因cDNA的克隆及表达[J]. 现代肿瘤医学, 2007, 15(5):593-595.

[6] Yan TQ, Jay S,Wunder MD,etal. COPS3, amplification and clinical outcome in osteosarcoma[J]. Cancer, 2007, 109(9):1870-6.

[7] 汤国庆, 燕太强, 郭 卫,等. 骨肉瘤肺转移相关基因的最新研究进展[J]. 中国骨与关节杂志, 2010, 9(4):368-372.

[8] 唐 彪, 段群欢. COPS3在肝癌中的表达[J]. 中国普外基础与临床杂志, 2015, 22(12):1507-1509.

[9] 孔庆彧, 崔久嵬, 于得海,等. RNA干扰COPS3表达对肺癌细胞增殖影响的分析[J]. 中国实验诊断学, 2012, 16(9):1550-1553.

[10] 汤国庆, 燕太强, 郭 卫,等. RNA干扰COPS3基因抑制骨肉瘤细胞HOS增殖和迁移能力的实验研究[J]. 中国骨与关节杂志, 2011, 10(1):54-57.

[11] 曹 鹤. RNA干扰COPS3 基因对肺癌细胞A549 增殖的抑制作用及其机制[J]. 吉林大学学报:医学版, 2014, 40(2):238-242.

(收稿：2016-12-07)

Effect of shRNA interfering COPS3 gene on human osteosarcoma cell line

Chen Jun,Jin Xuerong,Wang Xiang,et al.

Institute of Osteosarcoma, Tangdu Hospital, The Fourth Military Medical University( Xi’an 710038)

Objective: This paper evaluated the effect of shRNA interference COPS3 gene on the gene, protein level and proliferation ability of human osteosarcoma cells. Methods: Human osteosarcoma Saos-2 cells were selected in this study, the cells which infected shRNA pLKO.1-COPS3 virus plasmid were siCOPS3 Saos-2(treatment), meanwhile, which infected pLKO.1-TRC control virus plasmid were CON Saos-2(control). After infection completed, cells was cultured then collected for further analyzing. RT-PCR was used to determine mRNA expression of COPS3 gene, western blot was used to determine the level of protein expression, cell proliferation ability was measured by MMT method, nude mice were inoculated with cell suspension to show tumor formation. Results: In siCOPS3 Saos-2 cells, the mRNA expression level of COPS3 was decreased (P<0.05) , The level of protein expression, cell proliferation ability decreased, the interference of COPS3 gene inhibited tumor volume and weight increase (P<0.05) compared with the control group.Conclusion: The results of this study suggest COPS3 regulates the proliferation of osteosarcoma cells, and is closely related to the occurrence and development of osteosarcoma.

Osteosarcoma/physiopathology @shRNA interfering @COPS3 gene Lentivirus infections Cell proliferation

*国家自然科学基金资助项目(31470075)

骨肉瘤/病理生理学 @shRNA干扰 @COPS3基因 慢病毒感染 细胞增殖

R363

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.03.002

∆通讯作者