弹力纤维染色Gomori醛品红法的改良及应用体会

熊红梅，郭荣年，邱晓明

近几年，弹力纤维染色被广泛应用于病理诊断中，如肿瘤静脉浸润、浆膜浸润的判断，肿瘤早期浸润的确定、皮肤弹力纤维增生症等常常用到弹力纤维染色。皮肤组织HE染色中，弹力纤维与胶原纤维相似，均着染深浅不一的红色，两者较难区分，只有通过弹力纤维特殊染色才将两者显示出来。显示弹力纤维的方法很多，常用的有Gomori醛品红法、Weigert间苯二酚碱性品红法、维多利亚蓝法、Uana地衣红法等[1]，后三种方法染色时间均长，有些甚至要过夜。在常规病理检查工作中常用Gomori醛品红法，作者通过工作实践和摸索，对Gomori醛品红法进行了改良，效果良好，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1标本收集2014～2016年福建医科大学附属龙岩市第一医院皮肤科取材活检的皮肤组织30例，5例肺癌紧邻胸膜组织，3例肠癌标本中的动脉组织，每例标本均经10%中性福尔马林固定，常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡、包埋、切片、普通载玻片捞片、恒温箱(55 ℃)烤片过夜。其中每个蜡块均切5张，传统法切片3 μm厚，改良法切片5 μm厚，分5组。

1.2设备Tissue-Tik Vip6组织脱水机，Leica2245切片机，Olympus BX41普通光学显微镜

1.3试剂(1)醛品红染液：碱性品红0.5 g+70%乙醇100 mL+浓盐酸1 mL+三聚乙醛1 mL。先把碱性品红溶解于70%乙醇，然后加入浓盐酸和三聚乙醛，塞紧瓶盖，轻轻摇动使均匀混合，于室温下放3～4天(冬天时所需时间更长)，待转变为深紫色即为成熟可用，置4 ℃冰箱保存。(2)Lugol碘液：碘片1 g，碘化钾2.0 g，蒸馏水100 mL，先将碘化钾溶解于10 mL蒸馏水，加入碘片，轻轻摇动使之完全溶解后再加入其余蒸馏水，置4 ℃冰箱保存。(3)5%硫代硫酸钠液：硫代硫酸钠5 g+蒸馏水100 mL溶解混合，置4℃冰箱保存。(4)桔黄G液：桔黄G 2 g+磷钨酸5 g+蒸馏水100 mL，室温保存，取上清液使用。(5)0.5%高锰酸钾溶液：高锰酸钾0.5 g+蒸馏水100 mL混匀溶解棕色瓶装，置4 ℃冰箱保存。(6)酸性高锰酸钾溶液：0.5%高锰酸钾溶液与0.5%硫酸临用前等量混合。(7)2%过碘酸：过碘酸2 g+蒸馏水100 mL混匀溶解，置4 ℃冰箱保存。(8)3%过氧化氢溶液：为医用双氧水，本院药剂科提供。(9)70%乙醇：70 mL无水乙醇+30 mL蒸馏水配成，室温保存。(10)2.5%草酸溶液：2.5 g草酸+蒸馏水100 mL混合溶解，室温保存备用。所用试剂均为国产分析纯。

1.4染色方法(1)组：传统Gomori醛品红法[1]；(2)组：改良酸性高锰酸钾法；(3)组：改良0.5%高锰酸钾法；(4)组：改良2%过碘酸法；(5)组：改良3%过氧化氢法。5种具体染色方法见表1。

1.5观察方法显微镜观察染色切片，参照中华医学会编著《临床技术操作规范·病理学分册》常规石蜡切片质量评分标准[2]，省略其它项目的分值，仅对“染色清晰、对比度好”该项10分，应用于弹力纤维着色清晰度、对比度进行评分。用10×物镜观察弹力纤维，皮肤组织再用40×物镜观察耐酸纤维、前弹力纤维，>90%弹力纤维清晰着色鲜艳为9～10分，80%～90%为8～9分，70%～80%为7～8分，60%～70%为6～7分，依此类推，不着色为0分。

2 结果

38例组织5种方法染色质量平均分：传统法(1)组为4.20±1.19，改良法(2)组为9.43±0.50，(3)组为9.03±0.61，(4)组为8.80±0.84，(5)组为4.80±1.69，改良法(2)(3)(4)与传统法(1)比较差异有显著性(P<0.05)，改良法(5)与传统法(1)比较差异无统计学意义(P>0.05)，传统法与改良法染色结果比较见表2(图1～10)。

3 讨论

弹力纤维广泛分布于身体各处，特别在皮肤、血管壁、韧带、气管、支气管、肺泡、耳廓和腺体的导管处最为丰富，它由两种成分组成，即集合束的弹力微纤维(由糖蛋白形成)和均质状的弹力蛋白，弹力蛋白提供弹力纤维的弹性，弹力纤维在新鲜标本上呈黄色发亮的细线条状，在HE染色下，呈深浅不一的粉红色，与胶原纤维不易区别，为了更好地显示弹力纤维的病变，作者在传统法的基础上做了如下几个方面的改良：(1)氧化剂的改良：酸性高锰酸钾、高锰酸钾、过碘酸、过氧化氢均为氧化剂，弹力纤维的主要成分含有丰富的二硫键糖蛋白又称弹性蛋白，切片经上述氧化剂氧化后，弹力纤维内糖蛋白中已糖羟基转变为醛基与成熟的呈深紫色的醛品红染液具有较强的亲和力，与弹力纤维结合很紧。传统法Lugol碘液是碘和碘化钾的混合溶液，作为氧化剂，其氧化能力不强，只能显示部分弹力纤维，对较细的耐酸纤维、前弹力纤维未能显示，染色淡，不鲜艳清晰，对比度差，而且配制麻烦，需称取两种化学粉剂。经实践证明，其失效快，4 ℃冰箱保存仅3个月，超过3个月染色质量明显减弱。改良法中高锰酸钾是最强的氧化剂之一，深紫色结晶，光有催化分解作用，宜用棕色瓶室温保存。作为氧化剂受pH值影响很大，在酸性溶液中氧化能力最强，可明显提高其氧化作用，在病理实验室常用的浓度为0.25%～0.5%，作者用0.5%的高锰酸钾溶液，具有强烈的氧化作用，酸性高锰酸钾改良法中临用前在0.5%的高锰酸钾溶液中加入等量的0.5%硫酸，其氧化作用更强，能将弹力纤维系统的三种纤维成分均清晰显示出来，染色鲜艳，质量稳定，效果最佳，与传统氧化法相比，差异有显著性(P<0.05)。过碘酸也称高碘酸，白色结晶，无臭，有潮解性，粉剂宜置冰箱保存，属无机氧化剂，性质稳定，常用浓度0.5%～5%，作者用2%的过碘酸作用20 min，无需漂白的步骤，其染色质量稳定，效果也很理想，与传统法比较差异有显著性(P<0.05)。过氧化氢溶液为无色透明溶液，由于其性质活泼且容易分解，保存时应该尽量使用密闭容器，防止日光照射，而且不宜长时间储存，双氧水的工作性质是新生态氧，其有较强的氧化作用，又有漂白作用，市售浓度30%，医用浓度3%，本组实验采用3%过氧化氢溶液作用20 min，弹力纤维清晰，但由于其性质不稳定，不易储存，染色效果也不够稳定，塑料瓶装，刚开封使用，染色效果很好，着色鲜艳、清晰，随着放置时间的延长，氧化能力下降，即使在有效期内，染色效果也越来越差，特别在皮肤组织中弹力纤维不够清晰，对比度较差，但在胸膜、动脉中染色清晰，对比度好，这可能是由于弹力纤维在不同组织中的结构形式不同有关，如在皮肤组织中，弹力纤维呈单条出现；在胸膜、动脉中呈膜样结构[3]，镜下容易观察辨认。因此，与传统法比较差异无显著性(P>0.05)。(2)醛品红染液储存方式的改良：配好成熟后，用装免疫组化抗体的小塑料瓶分装，可以延长试剂有效期，减少三聚乙醛和乙醇的挥发，导致染液失效快，造成浪费，本实验室4 ℃冰箱保存可以10个月，甚至1年仍然有效。(3)染色方式的改良：由于染液中含乙醇易挥发，传统法采用立式染缸浸染，但浸染所用染液量多，造成浪费，而且对后面切片的染色不能保证试剂新鲜，容易污染。作者经改良采用滴染用孵育盒加盖的方式染色，可以保证试剂新鲜，且不致污染。为了不影响效果，避免染色过程中染液弥散，染色时70%乙醇浸洗完，用吸水纸擦干或让其自然凉干，再用固体石蜡在组织周边5 mm处划粗线条的圈，并且中途往切片上补滴染液1～2次，防止乙醇挥发导致干片。(4)醛品红染色时间延长到20 min，可使染色更加鲜艳、清晰。(5)分化是染色的关键，分化过久，已经染上的弹力纤维退色，分化不够，切片底色不干净，对比度不好，传统法分化用2次，每次30 s，笔者认为，时间太长，容易使弹力纤维退色，改良法分化时，左右振荡浸洗8～10 s比较适宜。(6)切片厚度的改良：作者切5 μm厚的切片比传统法常规3 μm、4 μm厚切片更容易观察弹力纤维的变化，染色清晰易辨。另外，在染色过程中还须注意：(1)桔黄G液要淡染，若过染则会掩盖弹力纤维的紫色，因此，滴入桔黄G液1 s后即水洗，如过染，水洗时间可长一些，如过淡，再染1 s后水洗。(2)皮肤组织必须切片完整[4]，更容易观察弹力纤维的连续性，完整性。但由于其表层细胞层次多，纤维组织与脂肪组织丰富，切片不易切全，易产生破碎，组织松散或切片厚薄不均等现象，为了切片完整，皮肤组织脱水、透明、浸蜡必须充分，切片时粗修完的蜡块必须充分冷冻，30～60 min，5 μm厚，另外，展片的水温不能过热，约40 ℃，以避免蜡带熔化造成组织分离或形成裂隙等假象。

表1 传统法与改良法的比较

表2 传统法与改良法的染色结果比较

①②③④⑤⑥⑦⑧

图1传统法：真皮深层见部分与表皮平行走向的粗弹力纤维，呈纤细的极淡紫色图2传统法：真皮乳头浅层未见耐酸纤维、前弹力纤维

图3改良酸性高锰酸钾法：真皮中见大量与表皮平行走向的紫色粗弹力纤维图4改良酸性高锰酸钾法：真皮浅层见细的淡紫色的前弹力纤维及与表皮基膜相连的耐酸纤维图5改良过碘酸法：真皮深层见大量与表皮平行走向的紫色粗弹力纤维图6改良过碘酸法：真皮浅层见细的淡紫色的前弹力纤维及与表皮基膜相连的耐酸纤维图7传统法：胸膜弹力纤维呈纤细的极淡的紫色图8改良高锰酸钾法：胸膜弹力纤维呈明显的深紫色

⑨⑩

图9传统法：动脉中的弹力纤维呈纤细的淡紫色图10改良过氧化氢法：动脉中的弹力纤维呈明显的深紫色

4种改良法与传统法相比，酸性高锰酸钾组、高锰酸钾组节约了漂白时间，仅用草酸1 min漂白，过碘酸及过氧化氢组均只须一步氧化，不需漂白，简化了染色步骤，而且传统法所需化学试剂品种多，配制麻烦，四种改良法氧化剂均单一，价廉，易得，是实验室常用的试剂。作者认为，对皮肤组织的弹力纤维染色时，选用改良的酸性高锰酸钾法、高锰酸钾法及2%过碘酸法较好，对浆膜、血管组织的弹力纤维染色，选用改良的4种方法均可，但是酸性高锰酸钾是值得推荐的最好的方法。

(本文经南京军区南京总医院病理科马恒辉指导，特此致谢！)

[1] 龚志锦, 詹榕洲. 病理组织制片和染色技术[M]. 上海: 上海科学技术出版社, 1994:82-87.

[2] 中华医学会. 临床技术操作规范·病理学分册[M]. 北京: 人民军医出版社, 2004:6.

[3] 梁英杰, 凌启波, 张 威. 临床病理学技术[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2011:102-103.

[4] 马恒辉, 周晓军. 组织切片常见问题与对策[J]. 临床与实验病理学杂志, 2009,25(2):211-214.