响应面法优化限制性酶解花生浓缩蛋白制备工艺研究

于丽娜，杜德红，彭娅萍，孙 杰，毕 洁，张初署，王明清

(1. 山东省花生研究所，山东 青岛 266100； 2. 青岛农业大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266109)

花生是豆科花生属草本植物，籽仁含油量高达50%，蛋白质含量25%～36%[1]。花生榨油后的花生饼粕含有50%左右的蛋白质，除了直接超微粉碎用于乳粉、肉制品等食品添加剂外，还可以将其生产出花生分离蛋白、花生浓缩蛋白、磷酸化改性花生蛋白、糖基化改性花生蛋白、限制性水解花生蛋白、各种功能活性的花生蛋白肽等产品，增加其附加值，丰富蛋白产品种类和用途[2-10]。其中，限制性水解花生蛋白由于蛋白分子轻微水解，使得蛋白分子变小，并含有少量功能性多肽，使其溶解性、乳化性、起泡性、持水性、吸油性等功能性质优于花生蛋白，且具有较好的抗氧化活性，更适合作为高端蛋白添加剂[11-13]。

本研究以低温冷榨花生蛋白粉为原料，用乙醇洗涤法得到花生浓缩蛋白，再经过超声波辅助蛋白酶解法制备限制性酶解花生浓缩蛋白，利用响应面试验优化了工艺条件，并研究了限制性酶解花生浓缩蛋白的功能特性和抗氧化活性，旨在为扩大花生浓缩蛋白的应用领域提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

低温冷榨花生蛋白粉：青岛长寿食品有限公司；盐酸、无水乙醇、氢氧化钠，均为分析纯试剂：上海国药集团化学试剂有限公司；Alcalase(2.4L FG，标称酶活2.4AU-A/g)：诺维信(中国)生物医药有限公司；十二烷基硫酸钠、DPPH：Sigma公司。

1.2 超声波辅助制备限制性酶解花生浓缩蛋白工艺

称取一定量花生蛋白粉倒入50mL塑料离心管中，加入一定量的70%乙醇溶液，旋涡混合器混合均匀；在超声波清洗器中以一定的超声波频率，超声波功率和温度，超声处理一定时间；在4000r/min转速下离心10min，弃去上清液；加入一定量水，旋涡混合器混合均匀，调节pH值，加入Alcalase(碱性蛋白酶)；在超声波清洗器中，以一定的超声波频率，超声波功率和温度，超声波辅助酶解一定时间；酶解结束后，在85℃水浴灭酶5min；灭酶结束后立即冷却，把反应体系倒入表面皿，冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机干燥，粉碎，待测。 1.3 超声波辅助制备限制性酶解花生浓缩蛋白试验设计

1.3.1 单因素试验

以底物浓度、pH值、加酶量、超声波频率、超声波功率、温度、时间作为试验因素，以溶解度和持水性作为考察指标进行试验设计，每组试验进行3次平行试验，取平均值作为试验结果。单因素基本试验条件为：底物浓度、pH值、加酶量、超声波频率、超声波功率、温度、时间。单因素试验的因素水平表见表1。

表1 单因素试验因素水平表

1.3.2 响应面(Response surface method, RSM)设计试验

在单因素试验基础上，固定：pH值9.0、超声波功率150w、超声波频率45kHz，以底物浓度(X1)、加酶量(X2，mL/g底物)、温度(X3，℃)和时间(X4，min)4个因素为自变量，运用Box-Benhnken试验设计，进行四因素三水平的响应面分析试验，以乳化活性指数溶解度和持水性作为响应变量(Y和Y')。各因素的编码和水平范围是：底物浓度(X1)，8%、10%、12%，加酶量(X2)12.50、23.75、35.00μL/g，温度(X3)50、56、62℃和时间(X4) 20、40、60min。

1.4 试验方法

1.4.1 功能性质的测定方法

等电点、溶解度、乳化活性指数和乳化稳定性、起泡性和泡沫稳定性、持水能力以及吸油性等功能性质测定方法按照Yu等[14]的方法进行。

1.4.2 抗氧化活性测定方法

清除DPPH自由基、清除羟自由基、清除超氧阴离子自由基、铁还原力、钼还原力、铜离子螯合力、铁离子螯合力、抑制脂质体过氧化等抗氧化活性测定方法按照Yu等[15]的方法进行。

1.5 统计分析

单因素与响应面试验重复3次，取平均值。响应面试验设计与分析采用Design-expert 8.0软件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 底物浓度对溶解度和持水性的影响

图1所示，随着底物浓度增加，溶解度先缓慢增大再减小，在底物浓度为12%出现最大值；持水性先增大再缓慢减小，最后趋于恒定，在底物浓度为6%出现最大值。底物浓度在4%～12%范围内，蛋白酶水解产生的小分子蛋白和多肽逐渐增加，溶解度增大；当底物浓度大于12%时，一定量的蛋白酶不足以水解这些底物，生成的小分子蛋白和多肽有所减少，因此溶解度减小。当底物浓度在4%～6%范围内，水解产物中的小分子蛋白、多肽和未水解蛋白的混合物有利于持水性的增大；当底物浓度大于6%时，由于溶解度增大，使得持水性减小。综合考察溶解度和持水性的变化，选择底物浓度8%～12%作为响应面试验因素水平。

2.1.2 pH值对溶解度和持水性的影响

pH值对蛋白酶的水解具有一定的影响。随着pH值的增大，溶解度逐渐增大；持水性先增大后减小再增大；最大值均在pH9.0处(图2)。通常情况下，Alcalase的适合pH值为6.5～9.0。由于花生蛋白的90%为盐溶性蛋白，pH值升高，有利于蛋白本身的溶解，使得蛋白酶解位点暴露出来，有利于小分子蛋白和多肽的生成，使溶解度逐渐增大。持水性在pH值为6.5～7.5范围内增大；当pH值大于7.5时，随着酶解产物中小分子蛋白和多肽的增多，持水性又减小。因此，选择pH值9.0作为响应面试验固定因素水平。

图1 底物浓度对限制性酶解花生浓缩蛋白溶解度和持水性的影响Fig.1 Effect of substrate concentration on solubility and water holding capacity of limited enzymatic hydrolysis peanut protein concentrate图2 pH值对限制性酶解花生浓缩蛋白溶解度和持水性的影响Fig.2 Effect of pH value on solubility and water holding capacity of limited enzymatic hydrolysis peanut protein concentrate

2.1.3 加酶量对溶解度和持水性的影响

随加酶量的增加，溶解度和持水性的变化趋势相似，都是先快速减小再缓慢增大而后又减小，两者最大值分别在加酶量12.5μL/g和27.5μL/g时(图3)。当加酶量为12.5μl/g时，蛋白酶与蛋白充分接触，水解得到的小分子蛋白和多肽较多，溶解度较大；当加酶量增大时，蛋白的酶促位点逐渐与增大的加酶量相吻合，产物中小分子蛋白和多肽逐渐增多，溶解度逐渐增大；当加酶量大于35μL/g时，加酶量趋于饱和，蛋白没有更多的酶促位点与蛋白酶结合，则产物中小分子蛋白和多肽减少，溶解度减小。因此，选择加酶量12.5～35.0μL/g作为响应面试验因素水平。

2.1.4 超声波频率对限制性酶解花生浓缩蛋白溶解度和持水性的影响

随着超声波频率的升高，溶解度和持水性都呈现出先增大后减小的趋势，在超声波频率为45kHz时出现最大值(图4)。当超声波在介质中传播时，由于超声波与介质的相互作用，使介质发生物理的和化学的变化，从而产生一系列力学的、热学的、电磁学的和化学的超声效应。超声波可以使蛋白分子结构变得松散，从而有利于酶解反应进行。因此，将超声波频率45kHz作为响应面固定试验因素水平。

2.1.5 超声波功率对限制性酶解花生浓缩蛋白溶解度和持水性的影响

超声波功率大小影响蛋白的分子结构变化，从而影响蛋白与酶分子的结合。随着超声波功率的增大，溶解度和持水性都呈现先减小后增大的趋势，分别在超声波功率240W和210W出现最小值(图5)。所以将超声波功率150W作为响应面试验固定因素水平。

图3 加酶量对限制性酶解花生浓缩 蛋白溶解度和持水性的影响Fig.3 Effect of enzyme dosage on solubility water holding capacity of limited enzymatic and hydrolysis peanut protein concentrate图4 超声波频率对限制性酶解花生 浓缩蛋白溶解度和持水性的影响Fig.4 Effect of ultrasonic frequency on solubility and water holding capacity of limited enzymatic hydrolysis peanut protein concentrate图5 超声波功率对限制性酶解花生 浓缩蛋白溶解度和持水性的影响Fig.5 Effect of ultrasonic power on solubility and water holding capacity of limited enzymatic hydrolysis peanut protein concentrate

2.1.6 温度对限制性酶解花生浓缩蛋白溶解度和持水性的影响

温度对酶解反应有一定的影响，蛋白酶只有在适合的温度下才具有较高的水解活力。图6所示，随着温度升高，溶解度和持水性都先减小后缓慢增大再缓慢减小，蛋白酶活性增大，水解产物中小分子蛋白和多肽增多，溶解度增加；当温度超过62℃时，花生蛋白开始变性，分子结构发生变化，酶促位点减少，水解产物中小分子蛋白和多肽减少，溶解度开始下降。因此，选择温度50～62℃作为响应面的试验因素水平。

2.1.7 时间对限制性酶解花生浓缩蛋白溶解度和持水性的影响

酶解反应需要一定的时间才能完成，图7所示，溶解度和持水性随着时间的延长先增大后减小最后再增大。超声波处理酶解反应体系时，蛋白大分子的氢键断裂，空间构象改变，增大了蛋白酶与底物分子的接触几率，酶解的小分子产物增多，溶解度逐渐增大。选择20～60min作为响应面时间因素的水平范围。

2.2 响应面试验结果与分析

2.2.1 模型的建立与显著性分析

根据RSM设计，选取29个试验点，表2为RSM设计及溶解度和持水性试验值。对表2结果进行二次多项式回归拟合，获得了预测相应值与底物浓度(X1)、加酶量(X2)、温度(X3)和时间(X4)的二次回归方程，如下：

溶解度=56.45+2.81X1+1.2X2-0.22X3+2.88X4+1.97X1X2+4.27X1X3+4.1X1X4+0.67X2X3+2.55X2X4+1.8X3X4+5.72X12+0.0042X22+5.47X32+4.68X42

持水性=6.73-0.35X1-0.32X2-0.32X3+0.0049X4+1.3X1X2+0.53X1X3+1.58X1X4+0.46X2X3+2.53X2X4+1.06X3X4-1.77X12-1.35X22-1.27X32-0.74X42

图6 温度对限制性酶解花生浓缩蛋白溶解度和持水性的影响Fig.6 Effect of temperature on solubility and water holding capacity of limited enzymatic hydrolysis peanut protein concentrate图7 时间对限制性酶解花生浓缩蛋白溶解度和持水性的影响Fig.7 Effect of time on solubility and water holding capacity of limited enzymatic hydrolysis peanut protein concentrate

对两个模型方程进行方差分析，结果见表3。溶解度模型显著(P<0.05)，持水性模型高度显著(P<0.01)，表明两个方程对试验结果的拟合情况较好，因此可用回归方程对试验真实值进行分析和预测。两个模型的校正决定系数(Adjusted coefficient of determination,RAdj2)分别为0.555和0.6979，表明两个方程约有55%的溶解度和69%的持水性变异分布在所研究的4个相关因素中，其总变异度仅有45%和31%不能用模型解释。两模型的相关系数(Correlation coefficient，R)分别为0.8818和0.9214，表明溶解度和持水性的预测值和试验值之间具有高度的相关性。失拟项P为0.8893和0.7437，它们都大于

表2 RSM设计及结果

表3 回归模型方差分析

注：P≤0.05，影响显著；P≤0.01，影响高度显著；P≤0.001，影响极显著；P>0.05，影响不显著。

Note:P≤0.05,P≤0.01,P≤0.001 andP>0.05 represent the influence of significant, high significant, extremely significant and insignificant level, respectively.

0.05，表明方程的拟合不足检验不显著，二次响应面回归方程能很好地拟合本试验所得的结果，自变量与响应值之间线性关系显著，该模型可用于溶解度和持水性的理论预测。模型的变异系数(Coefficient of variation, CV)分别为6.58%和22.48%，也表明方程拟合度较好。

二次模型中回归系数的显著性检验见表4。溶解度模型中，因素X1和X4对溶解度的线性效应显著；因素X22对溶解度的曲面效应极显著；持水性模型中，X2X4对持水性的交互影响极显著，X1X4对持水性的交互影响高度显著，X1X2对持水性的交互影响显著；因素X12对持水性的曲面效应极显著，因素X22和X32对持水性的曲面效应高度显著；表明试验因素对响应值不是简单的线性关系，二次项对响应值也有很大的关系，交互项影响也显著。

由溶解度响应面模型回归方程可以分析出，在影响溶解度的因素中，底物浓度、加酶量和时间与溶解度呈正相关，温度与溶解度呈负相关。由持水性响应面模型回归方程可以分析出，在影响持水性的因素中，时间与持水性呈正相关，底物浓度、加酶量和温度与持水性呈负相关。比较响应面模型二次多项式方程中一次项的方差的大小，可以判断影响因素的主次顺序。各因素对溶解度影响程度大小为X4>X1>X2>X3，对持水性影响程度大小为X1>X2>X3>X4。

表4 回归方程系数显著性检验

注：P≤0.05，影响显著；P≤0.01，影响高度显著；P≤0.001，影响极显著；P>0.05，影响不显著。

Note:P≤0.05,P≤0.01,P≤0.001 andP>0.05 represent the influence of significant, high significant, extremely significant and insignificant level, respectively.

2.2.2 模型的建立与显著性分析

对试验模型进行典型性分析，获得超声波辅助制备限制性酶解花生浓缩蛋白的最优条件为底物浓度8.04%，加酶量12.5μL/g，温度50.75℃，时间20.99min，溶解度和持水性理论值分别为77.63%和9.77mL/g。为检验响应面方法的可行性，并综合考虑实际操作的便利性，将工艺参数修正为：底物浓度8.1%，加酶量12.5μL/g，温度51℃，时间21min进行超声波辅助制备限制性酶解花生浓缩蛋白的试验。3次平行试验得到的平均溶解度和持水性分别为78.89±0.53%和9.58±0.26mL/g，溶解度和持水性值与理论值分别相差1.62%和1.94%，差值都在2%以内，说明模型与实际情况拟合较好，验证了所预测模型的正确性。因此，响应面法对超声波辅助制备限制性酶解花生浓缩蛋白工艺条件参数优化是可行的，得到的工艺条件具有实际应用价值。

2.3 限制性酶解花生浓缩蛋白的功能性质研究

2.3.1 等电点

随着pH值的升高，限制性酶解花生浓缩蛋白的吸光值先减小再增大，在pH值为4.0时出现最小值，即等电点在pH4.0(图8)。花生蛋白的等电点在pH4.5，限制性酶解花生浓缩蛋白的等电点小于花生蛋白。其主要原因是，花生蛋白经过蛋白酶水解后，有小分子蛋白和多肽生成，这些都是两性物质，疏水基团增加，使得等电点降低。限制性酶解花生浓缩蛋白的等电点减小，有利于其在食品加工中的应用。

2.3.2 溶解度

随着pH值的升高，溶解度先减小再增大，pH 4.0出现最小值，与等电点的变化趋势一致(图9)。当pH值大于6.0时，溶解度就大于60%，有利于将精制水解花生蛋白应用于蛋白饮品中，提高蛋白饮品的蛋白含量和质量。

图8 限制性酶解花生浓缩蛋白的等电点Fig.8 Isoelectric point of limited enzymatic hydrolysis peanut protein concentrate图9 限制性酶解花生浓缩蛋白的溶解度Fig.9 Solubility of limited enzymatic hydrolysis peanut protein concentrate

2.3.3 乳化活性

pH 2～9范围内，乳化活性指数先减小后缓慢增大；当pH值大于10.0时，乳化活性指数快速增大；乳化稳定性指数先减小再增大；两者都在pH值为4.0时出现最小值，与等电点的变化趋势一致(图10)。这些功能特性非常有利于限制性酶解花生浓缩蛋白的加工特性。

2.3.4 起泡性

由图11可看出，随着pH值的升高，起泡性先减小后缓慢增大，pH 4.0时出现最小值，与等电点的变化趋势一致；泡沫稳定性逐渐增大。限制性酶解花生浓缩蛋白的起泡性在各个pH值很小，主要因为花生蛋白经过水解，有小分子蛋白和多肽生成，破坏了蛋白的表面张力作用，导致起泡性较小。

2.3.5 持水性

图12所示，随着蛋白浓度增大，持水性逐渐减

图10 限制性酶解花生浓缩蛋白的乳化活性指数和乳化稳定性指数Fig.10 Emulsifying activity index and emulsion stability index of limited enzymatic hydrolysis peanut protein concentrate图11 限制性酶解花生浓缩蛋白的起泡性和泡沫稳定性Fig.11 Foaming ability and stability of limited enzymatic hydrolysis peanut protein concentrate

图12 限制性酶解花生浓缩蛋白的持水性Fig.12 Water binding capacity of limited enzymatic

hydrolysis peanut protein concentrate

图13 限制性酶解花生浓缩蛋白的吸油性

Fig.13 Oil absorption of limited enzymatic

hydrolysis peanut protein concentrate

小，与蛋白浓度呈二次项关系，二次回归方程为y= 0.1197x2-1.2598x+ 4.5883，R2= 0.9807。

2.3.6 吸油性

图13表明，随着蛋白浓度增大，吸油性逐渐减小，与蛋白浓度呈二次项关系，二次回归方程为y= 0.976x2-9.5231x+ 25.523，R2=0.9793。

2.4 抗氧化活性研究

表5表明，限制性酶解花生浓缩蛋白的抗氧化活性的IC50值都很小，抗氧化活性很高。花生蛋白经过蛋白酶水解后，生成小分子多肽，具有清除自由基、还原力、金属离子螯合力和抑制脂质过氧化的抗氧化活性。限制性酶解花生浓缩蛋白具有这四大类抗氧化活性，说明限制性酶解花生浓缩蛋白作为食品原料添加到食品中，除了提供食品必要的蛋白、氨基酸营养成分外，还可以起到天然抗氧化剂的作用。

表5 限制性酶解花生浓缩蛋白的抗氧化活性

3 结 论

通过采用超声波辅助碱性蛋白酶酶解方法，得到限制性酶解花生浓缩蛋白的最佳制备工艺；同时研究了限制性酶解花生浓缩蛋白的功能特性和抗氧化活性。本研究得到的限制性酶解花生浓缩蛋白产品具有较好的溶解性、乳化性等功能特性；并且，由于蛋白酶的轻度水解，酶解产物中含有花生多肽，使得限制性酶解花生浓缩蛋白还具有较好的清除自由基活性、还原力、金属离子螯合力和抑制脂质过氧化活性。限制性酶解花生浓缩蛋白可以进一步开发为乳制品、肉制品、焙烤制品等食品专用蛋白基料，为冷榨花生粕的高值化利用提供新途径。

[1] 张严,谢岩黎,孙淑敏,等. 近红外分析花生籽粒脂肪酸含量的研究[J]. 河南工业大学学报(自然科学版), 2014, 35(2): 54-58.

[2] 赵雪淞,张鑫磊,刘民. 醇法生产花生浓缩蛋白的工艺条件研究[J]. 中国油脂, 2014, 39(8): 30-33.

[3] 张慧娟,李莹莹,王静,等. 醇洗法纯化高温花生粕分离蛋白的研究[J]. 食品工业科技, 2015, 36(6): 245-250.

[4] 熊柳,孙高飞,王建化,等. 花生分离蛋白磷酸化改性研究[J]. 食品科学, 2010, 31(10): 35-41.

[5] 王强,王春艳,胡晖,等. 花生ACE抑制肽结构表征与构效关系[J]. 食品科学, 2013, 34(9): 170-174.

[6] 宁庆鹏,王常青,方甜,等. 酶法制备花生粕醒酒多肽[J]. 食品科学, 2016, 37(13): 173-177.

[7] 周菲菲,肖更生,唐道邦,等. 食品加工中蛋白质的糖基化改性[J]. 食品工业科技, 2013, 34(21): 390-393,399.

[8] 尚新彬,王富刚,豆康宁. 花生肽抗氧化性及抗氧化稳定性的研究[J]. 中国油脂, 2015, 40(2): 33-36.

[9] 李润国,庞文渌. 酶解法制备花生粕高F值寡肽混合物及其缓解疲劳作用的研究[J]. 粮油食品科技, 2015, 23 (1): 43-46.

[10] 张国治,李若昀,白歌,等. 用2709碱性蛋白酶水解醇洗花生蛋白制备血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽[J]. 河南工业大学学报，2016, 37(2): 64-71.

[11] 金华丽,郑静静. 磷酸化预处理对花生蛋白酶解特性的影响[J]. 河南工业大学学报(自然科学版), 2015, 36(1): 8-11.

[12] 封小龙,刘红芝,刘丽,等. 修饰改性对花生蛋白组分结构与功能性质影响的研究进展[J]. 中国食品学报,2014,14(4): 179-183.

[13] 芦鑫,张丽霞,孙强,等. 花生蛋白制备和应用研究[J]. 食品工业科技, 2012, 33 (8): 444-447.

[14] Yu L N, Yang W Q, Sun J, et al. Preparation, characterisation and physicochemical properties of the phosphate modified peanut protein obtained fromArachinConarachinL [J]. Food Chemistry, 2015, 170: 169-179.

[15] Yu L N, Sun J, Liu S F, et al. Ultrasonic-assisted enzymolysis to improve the antioxidant activities of peanut (ArachinconarachinL.) antioxidant hydrolysate [J]. International Journal of Molecular Sciences [J]. 2012, 13: 9051-9068.