花生CAX相互作用蛋白4(CXIP4)基因克隆表达分析及载体构建

吴 琪，曹广英，唐月异，王秀贞，孙全喜，王志伟，陈剑洪，姜启双，王传堂

(1.山东省花生研究所，山东 青岛 266100； 2.吉林农业大学，吉林 长春 130118；3.福建省泉州市农业科学研究所，福建 泉州362212；4.山东省临沭县农业局，山东 临沭 276700)

钙是细胞信号传导中重要的第二信使，在很多胞内信号网络中起重要作用[1-2]。通过对细胞质中Ca2+浓度的精细调控，细胞将遗传信号转化为特定的细胞事件，其中负责细胞质中Ca2+浓度升高的流入系统主要包括钙离子通道(Ca2+channels)，Ca2+浓度降低的流出系统主要包括钙泵(Ca2+pumps)和反向转运蛋白(antiporters)[3]。Cation exchanger(CAX)是一种定位于生物膜(液泡膜，质膜)的反向转运蛋白，选择性转运Ca2+等阳离子，该基因首先在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)Ca2+敏感型突变体中被克隆[4-5]。在Ca2+完成信使作用后，CAX主要参与Ca2+转运至胞内和胞外的钙库，使细胞质中的Ca2+恢复到静息电位，为下一次信号的起始做好准备，同时解除了离子对细胞的毒害作用，保证胞内各种生理、生化反应顺利进行，对Ca2+信号传导和细胞正常生理、生化活动起重要作用[2]。CAX interacting protein(CXIP)是一类能够激活CAX的钙离子转运活性的蛋白，也在离子转运体系中起重要作用。在模式生物拟南芥中研究发现，AtCAX1的N末端调节区域能被CXIP4(CAX interacting protein 4)激活[6-8]。本研究获得了花生CXIP4基因全长序列，对其组织表达及胁迫表达情况进行了分析，并构建了其过表达载体、反义干扰载体以及原核表达载体，为进一步研究该基因在花生青枯病中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

花生材料为栽培品种日花1号，菌株为日照青枯菌菌株[9]。

1.2 青枯菌活化

将-80℃保存的青枯菌菌株划线培养于YGPA培养基上(葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，酵母提取物0.5%，琼脂1.8%，pH7.2)，28℃培养48h。挑单菌落于5 mL YGPA液体培养基中活化，28℃，220 r/min振荡培养48 h。取1mL菌液于50 mL YGPA液体培养基中大量培养约4 h，使用显微镜和血球计数器将培养好的青枯菌菌液稀释到终浓度为109CFU。

1.3 总RNA提取

取花生种子1粒，液氮下研磨成粉，取0.1g粉末，向其中加入800μL SDS提取液及125μL β-巯基乙醇，旋涡混匀，静置1 min，4℃ 15000 r/min离心5 min；吸取上清，并加入500μL氯仿和500μL Tris-饱和酚，混匀、静置，4℃ 12000 r/min离心5 min；取上清，加入400 μL 3 mol/L醋酸钠(pH 4.8)、500μL氯仿及500 μL水饱和酚，混匀，静置，4℃ 12000 r/min离心5 min；取上清加入等体积异丙醇，-20℃沉淀，4℃ 12000 r/min离心10 min，弃上清；用1 mL 75%乙醇漂洗沉淀，风干后加入50 μL ddH2O溶解。按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech，USA)说明书反转录合成cDNA。

1.4 cDNA序列和DNA序列获得

根据Genefishing技术获得的EST序列(已包括3'末端序列)，使用premier primer 5.0软件，设计5'RACE基因特异性引物GSP1和GSP2(附表)。反应体系(25 μL)为2.5 μL 10×Buffer(Mg2+)(Takara，Japan)，1.5 μL dNTP(Takara)，2.5 μL UPM(10×)，0.5μL GSP1/GSP2(10 μmol/L)，1.0 μL 5'-RACE-Ready cDNA(30 ng/μL)，17 μL ddH2O，0.25μL rTaq(Takara)。第一轮反应程序为：94℃预变性30 s，72℃延伸3 min，5个循环；94℃变性30 s，70℃退火30 s，72℃延伸3 min，5个循环；94℃变性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸3 min，25个循环。第二轮反应反应程序为：94℃变性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸3 min，30个循环。反应完成后，使用添加1μL Super GelRed (US， Everbright Inc)1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，纯化后进行克隆测序。

使用BioEdit 7.0.9.0软件[10]将测序结果进行拼接。根据拼接序列设计基因全长引物F/R(附表)，分别以cDNA和DNA为模板进行PCR扩增。将得到的PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶上进行检测，并纯化后进行克隆测序。

1.5 序列分析

序列多重比对采用ClustalX软件进行分析；用Protparam程序(http://www. expasy.ch/tools/protparam.html)对蛋白的基本物理化学性质预测；蛋白的二级结构预测采用Predictprotein (http://www.predic-tprotein.org)，三级结构预测由SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)完成，Plant-mPLoc程序预测基因亚细胞定位情况(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)，采用邻接法(Neighbor-Joining)构建基因系统发育树。

1.6 组织表达及胁迫表达情况

挑选大小均匀的种子，先用70%酒精浸泡20s，再用0.1%的升汞浸泡10 min进行表面消毒，用无菌水漂洗5次。

组织表达：将种子催芽萌发后播种，置于25℃，12h光照的培养箱中培养。30d后取9株长势无明显差异植株，随机分为3组，分别取其根、茎、叶组织，经液氮速冻后，放于-80℃冰箱中保存备用。

胁迫表达：取48粒种子催芽萌发，出芽后移至清水中，25℃光照培养箱中培养。隔1d换一次水，培养45d后，将花生植株随机等分为两组。采用伤根灌菌法，将两组花生主根用刀片划1 mm左右切口，其中实验组置于青枯菌菌液中，对照组放入无菌水中。按以下时间分别取样：0 h、0.5 h、1h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h，每个时间点分别从实验组和对照组各取3个植株根部组织，液氮速冻，放于-80℃冰箱保存备用。

提取上述材料的总RNA，并根据试剂盒操作手册反转录得到cDNA(abm，Canada)，利用DEPC处理水将cDNA稀释10倍用于荧光定量实验。

荧光定量PCR(qRT-PCR)使用Applied Biosystems 7500 Fast荧光定量PCR仪进行。PCR反应体系(20 μL)为：10 μL EvaGreen 2×qPCR MasterMix(Abm，Canada)，qF和qR(附表)引物各0.5 μL，1.0 μL cDNA模板，8 μL ddH2O，用β-actin作为内参。数据分析采用2-ΔΔCt算法[11]，每个样品重复3次取平均值。

1.7 载体构建

以cDNA为模板，利用过表达引物oeF/oeR及反义表达引物iF/iR进行PCR扩增，纯化产物。将载体pCAMBIA2300进行酶切反应，反应体系(50 μL)为：5 μL10×CutSmartTMBuffer(NEB，UK)，1 μL内切酶BamHI-HF，10 μL载体pCAMBIA2300质粒，34 μL ddH2O。将上述体系混合后，37℃酶切5h。将酶切载体pCAMBIA2300纯化后与PCR纯化产物进行连接实验，反应体系(10 μL)为：2 μL 5×In-Fusion HD Enzyme Premix(Takara，Japan)，3 μL PCR纯化产物，1 μL酶切载体pCAMBIA2300，4 μL ddH2O。将上述体系混和后50℃水浴15min，再冰浴10min。将上述连接液转入DH5a感受态细胞(Transgen Biotech, Beijing)，PCR鉴定得到的阳性单菌落摇菌并提取质粒，再转化到农杆菌感受态细胞EHA105中，28℃倒置培养3 d，进行PCR筛选，获得阳性菌落。 原核表达载体构建使用pF/pR引物扩增基因cDNA全长，产物纯化后，与原核表达载体pEASY-Blunt E1(Transgen Biotech)连接并转化Trans1-T1(Transgen Biotech)原核表达感受态细胞。连接体系为(5μL)：载体1μL，PCR产物4μL，25℃ 5min。经PCR筛选，获得阳性菌落。

附表 试验中所用的引物序列

2 结果与分析

2.1 CXIP4基因cDNA序列及DNA序列

CXIP4基因cDNA序列包含一个966 bp的开放阅读框(ORF)，编码321个氨基酸(图1)。预测的蛋白质分子量大小为36706.24 Da，等电点为9.62。由SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/)建立的CXIP4基因的3D模型如图2，其二级结构中包含α-螺旋34.89%，无规则卷曲48.29%，β-转角7.48%(图2)。CXIP4基因DNA序列无内含子。氨基酸组成显示：其富含Arg(13.66%)、Lys(12.11%)、Asp(12.42%)、Ser(13.04%)。N端包含一个锌指结构域CCHC(84-100)。亚细胞定位预测显示其定位在细胞核。

图1 CXIP4基因cDNA序列 Fig. 1 cDNA sequence for CXIP4 gene from A. hypogaea

图2 (a)CXIP4基因的二级结构预测； (b)CXIP4 3D结构预测 Fig. 2 (a) The secondary structure prediction of CXIP4 from A. hypogaea; (b) Predicted 3D structure of CXIP4 protein of A. hypogaea 注： h: α-螺旋；e: 延伸链；t: β-转角；c: 无规则卷曲 Notes: h: alpha helix; e: extended strand; t: beta turn; c: random coil

2.2 系统进化分析

从GenBank数据库中下载来自其他物种的CXIP4基因cDNA序列。使用ClustalX程序进行比对，并绘制系统进化树。如图3所示，CXIP4基因序列相对保守，尤其是在豆科植物中。系统进化树显示(图4)，花生CXIP4基因与大豆CXIP4基因、鹰嘴豆CXIP4基因、百脉根CXIP4基因聚在一起，说明此基因在豆科中高度保守且具有较近的亲缘关系；而二倍体棉花单独为一支。

图3 CXIP4基因序列比对 Fig. 3 The alignment of the amino acid sequences of CXIP4注：大豆(Glycine max，XM_003536681.3)；鹰嘴豆(Cicer arietinum，XM_004497167.2)；百脉根(Lotus japonicus，BT142030.1)；二倍体棉花(Gossypium raimondii，XR_001132960.1)Notes: The sequences used are as follows: Glycine max (XM_003536681.3), Cicer arietinum (XM_004497167.2)，Lotus japonicus(BT142030.1)，Gossypium raimondii(XR_001132960.1)

图4 邻接法(Neighbor-Joining)构建CXIP4基因系统发育树 Fig. 4 Consensus Neighbor-Joining (NJ) tree for CXIP4 gene

2.3 组织表达及胁迫表达

用荧光定量PCR技术(qRT-PCR)检测CXIP4基因组织表达和胁迫表达。结果显示CXIP4基因在花生叶片中表达量最高，是根中的4倍(图5)。在青枯菌胁迫条件下该基因在0.5 h表达量突增到起始值的3.4倍，在3 h和6 h表达量又趋于下降，而后在12 h时又有所上升，在48 h表达量达到起始值的1.7倍，未恢复到初始水平 (图6)。

2.4 过表达载体及反义表达载体构建

以cDNA为模板，分别用过表达引物oeF/oeR及反义表达引物iF/iR进行PCR扩增，产物纯化并与酶切后的pCAMBIA2300载体进行连接，转化DH5α感受态细胞后筛选阳性菌落(图7左)，并提取构建好的过表达载体质粒和反义表达载体质粒(图7右)，将重组质粒转化农杆菌感受态细胞EHA105。

图5 CXIP4基因组织表达分析 图6 CXIP4基因青枯菌胁迫表达情况 Fig. 5 The expression level of CXIP4 gene Fig. 6 The expression profile of CXIP4 gene mRNA transcripts in roots, stems and leaves in R. solanacearum treated roots

图7 PCR鉴定大肠杆菌阳性菌落(左)以及重组质粒提取(右) Fig. 7 The identification of positive E.coli clonies (left) and the extraction of recombinants (right)注：左：M: Marker (Trans 2K Plus II DNA Maker)；泳道1: CXIP4基因过表达载体插入片段；泳道2: CXIP4基因反义表达载体插入片段。右：M: Marker (Trans 2K Plus II DNA Maker)；泳道1: 过表达载体质粒；泳道2: 反义表达载体质粒。Notes: Left: M: Marker (Trans 2K Plus II DNA Maker); Lane 1: the inserts of CXIP4 overexpression vector; Lane 2: the inserts of CXIP4 antisense expression vector. Right: M: Marker (Trans 2K Plus II DNA Maker); Lane 1: the extraction of an overexpression vector recombinants in E. coli; Lane 2: the extraction of an antisense expression vector recombinants in E. coli.

图8 PCR鉴定农杆菌阳性菌落 图9 PCR鉴定原核表达的阳性菌落Fig. 8 The identification of Agrobacterium positive clonies Fig. 9 The identification of prokaryotic 注：M: Marker (Trans 2K Plus II DNA Maker)； expression vector positive clonies 泳道1: CXIP4基因过表达载体插入片段； 注：M: Marker (Trans 2K Plus II DNA Maker)；泳道2: CXIP4基因反义表达载体插入片段 泳道1-2: CXIP4基因原核表达载体插入片段Notes: M: Marker (Trans 2K Plus II DNA Maker); Notes: M: Marker (Trans 2K Plus II Lane 1: the inserts of an overexpression vector DNA Maker); Lane 1-2: the inserts in Agrobacterium; Lane 2: the inserts of an of CXIP4 prokaryotic expression vector.antisense expression vector in Agrobacterium.

2.5 原核表达载体的构建

利用设计好的原核表达引物pF和pR进行PCR扩增，并进行产物纯化，将载体pEASY-Blunt E1 Expression Vector与PCR纯化产物进行连接实验，转入BL21表达感受态细胞后筛菌，得到的阳性单菌落PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶上进行检测，分析得到目的条带如图9所示。

3 讨 论

CAX在维持细胞质内Ca2+的动态平衡中起至关重要的作用[8]。在拟南芥中CXIP4能够激活CAX1的反向离子转运活性[2, 12]。研究表明，细胞内Ca2+浓度与植物生长、发育以及生物胁迫和非生物胁迫下的抗性有相关性[13-16]。本研究中CXIP4基因是使用Genefishing技术分离得到的花生青枯病抗性相关基因，推测其可能通过对CAX的激活作用调节Ca2+浓度，改变植物体内的信号，从而调节植株抗病能力。本研究得到的CXIP4氨基酸序列在豆科植物中具有高度保守性，并利用qRT-PCR分析了其在花生品种“日花1号”植株中的组织表达和青枯菌胁迫条件下的表达变化规律，结果显示，CXIP4基因在花生叶片中表达量最高，在青枯菌胁迫条件下该基因在0.5 h表达量突增到起始值的3.4倍，并构建该基因过表达载体、反义干扰载体以及原核表达载体，这为后续研究该基因在花生Ca2+转运、调节以及其在花生抗青枯病中的作用奠定了基础。

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