M细胞及其在病原入侵中的作用研究进展

李任峰,王自良,赵 坤,王丽荣,张守平,王三虎

(河南科技学院动物科技学院，河南新乡 453003)

M细胞及其在病原入侵中的作用研究进展

李任峰,王自良,赵 坤,王丽荣,张守平,王三虎*

(河南科技学院动物科技学院，河南新乡 453003)

M细胞又称微皱褶细胞(microfold cell)或膜性细胞(membranous cell)，是组成黏膜免疫屏障的一类重要上皮细胞，在黏膜免疫和病原入侵方面发挥重要功能。论文就M细胞的形态、功能及其在病原入侵中的作用进行综述，以期拓展对M细胞的认识以及引起兽医领域对M细胞研究的关注。

微皱褶细胞；黏膜免疫；病原入侵

黏膜免疫系统是人和动物抵抗病原微生物入侵的第一道免疫屏障，自20世纪60年代黏膜免疫的概念首次被提出以来，就一直受到国内外学者的关注。事实上，除极少数病原体通过节肢动物或其他动物的叮咬、注射、输血等途径入侵机体以外，绝大多数病原体都是通过黏膜入侵的[1]。如人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)、脊髓灰质炎病毒、结核分支杆菌等，以及猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪流感病毒(Swine influenza,SIV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、鸡传染性支气管炎病毒等(Infectious bronchitis virus,IBV)。但令人奇怪的是，迄今已研制的大部分疫苗都是针对外周免疫系统，在疫苗设计及疫苗评价时，很少有人考虑将黏膜免疫作为重要指标[2]。

猪的肠道黏膜免疫系统主要由黏膜淋巴集合体以及弥散黏膜淋巴组织组成的肠相关淋巴组织(gut associated lymphoid tissue,GALT)构成[3]。黏膜淋巴集合体主要指分布于肠道的集合淋巴小结，即Peyer淋巴结(Peyer's patches,PPs结)。M细胞又称微皱褶细胞(microfold cell)或膜性细胞(membranous cell)，作为一种极化的上皮细胞，M细胞最早发现于人肠道PPs结上的滤泡相关上皮(follicle associated epithelium,FAE)[4]。除了FAE中的M细胞外，在小鼠的小肠绒毛上皮也发现M细胞的存在[5]。位于FAE的M细胞数量较少且相对稳定，而绒毛上皮中的M细胞受抗原刺激后数量更容易增加。有利于机体对外界抗原的摄取和递呈，从而增强机体的免疫应答能力[6]。因此，对于绒毛M细胞的研究越来越受到重视。

1 M细胞的形态结构及其体外培养模型

典型的M细胞形态学特征是其基底部细胞膜向顶部内凹形成“口袋状”腔室，内含T淋巴细胞、B淋巴细胞、吞噬细胞及树突状细胞等；M细胞的胞质较少，其顶面(面对肠腔方向)缺乏刷状缘和黏液层，并缺乏碱性磷酸酶活性，不具有吸收上皮和消化营养物质的酶学机制，细胞内缺乏水解酶。这些结构特征不仅有利于肠腔内物质更易于接近M细胞的表面，而且有利于抗原物质在M细胞内快速转运而不致被降解[7]。M细胞的形态在不同种类动物间存在差异, 甚至同一动物不同部位也有差异。人类肠道M细胞表面缺乏微绒毛，鼠M细胞表面的微绒毛短而不规则，而兔M细胞表面的微绒毛较其邻近肠上皮细胞上的微绒毛长。另外，不同种类动物体内M细胞表面的糖蛋白不同，如鼠小肠PP结内M细胞可以用岩藻糖凝集素(ulexeuropeus agglutinin1,UEA1)特异性检出, 而人则不可；人M细胞表面糖基化不同，它表达唾液酸Lewis抗体, 但它不是M细胞的表面标志, 它也可以在滤泡相关上皮细胞( follicle associated epithelial cell,FAE)和杯状细胞上表达；兔M细胞的特异性结合凝集素也可由波形蛋白(Vementin)抗体特异性识别[8-9]；猪回肠内M细胞在隐窝上皮内大多数呈现柱状, 并且从隐窝上皮到圆顶上皮内，M细胞呈现出由柱状细胞形态到“口袋状”细胞形态的逐渐转变，散在分布于猪的回肠肠绒毛处的M细胞全都是与吸收性肠上皮细胞形态相似的柱状[10]。

构建M细胞体外培养模型是研究M细胞功能的重要工具。由于在PPs结和小肠绒毛上皮中M细胞的数量相对较少，从体内分离原代M细胞培养较为困难。采用人的结肠腺癌细胞(Caco-2)与来自PP结中的B淋巴细胞共培养，能够使Caco-2转化成具有M细胞的形态和功能，该模型目前已用于多个病原体的体外入侵及纳米药物转运研究[11-13]。另外，NF-κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)是刺激肠上皮细胞分化为M细胞的必需成分，可以通过小鼠体内注射抗RANKL单克隆抗体或构建RANKL基因敲除小鼠研究M细胞在病原入侵及抗原转运方面的功能[14-16]。Rouch J D等[17]将分离的人小肠隐窝进行单层培养，并加入适当浓度的重组RANKL进行刺激，建立了具有典型M细胞形态和功能的细胞模型。最近，Chaikhumwang P等[18]通过肠上皮细胞与(C2BBe1)和Raji B cells共培养的方法建立了M细胞体外培养模型，并证实了表皮生长因子(epithelial growth factor,EGF)在促进细胞互作方面的功能。以上这些模型的建立为进一步研究M细胞在病原体入侵和抗原转运方面的功能提供了重要工具。

2 M细胞在病原入侵中的作用

M细胞以受体介导或非受体胞吞方式摄取抗原，并特异性地将抗原转运至上皮下的抗原递呈细胞进行识别、处理并激活淋巴细胞，继而启动黏膜免疫应答[19]。然而，M细胞独特的形态学结构也为许多病原体的入侵提供了门户，成为许多病原体突破黏膜屏障的主要途径[20]。多种病毒和革兰阴性细菌能够选择性黏附M细胞，某些细菌如霍乱弧菌和大肠埃希菌经M细胞转运后可产生免疫应答而不导致黏膜疾病,其他一些细菌如伤寒杆菌、鼠伤寒沙门菌、单核细胞增生李斯特菌、福氏志贺菌、小肠结肠炎耶尔森菌、假单核耶尔森菌和空肠弯曲菌等经M细胞转运后可导致局部黏膜炎症和全身感染[21-22]。

为了弄清呼肠病毒(Reovirus)与肠道M细胞之间的相互作用机制，Amerongen H M等[23]分别用天然呼肠病毒粒子、呼肠病毒亚病毒粒子及呼肠病毒核心(缺乏外膜蛋白)感染小鼠，结果表明，只有经蛋白裂解酶处理过的呼肠病毒亚病毒粒子能吸附于M细胞的表面，因此，天然呼肠病毒粒子本身并不能感染肠道M细胞，只有在肠腔内经蛋白酶裂解为亚病毒粒子中间体后才具有吸附M细胞的能力，这为呼肠病毒的致病机制研究提供了新的参考。为了研究脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)的感染机制，Ouzilou L等[24]在建立M细胞模型(由人结肠癌细胞和肠道淋巴细胞共培养)的基础上，系统研究了脊髓灰质炎病毒在M细胞中的转运机制，发现M细胞转运脊髓灰质炎病毒过程具有温度依赖性，而且在缺乏特异性受体(CD155)时，M细胞的吸附和转运效率较低，经过转运的脊髓灰质炎病毒通过内皮细胞的基底面外侧(此处覆盖有CD155受体分子)感染内皮细胞，被感染的细胞会随即释放病毒粒子进入肠腔，进而使得脊髓灰质炎病毒在肠道内的感染得到放大。为了弄清HIV早期入侵上皮细胞的机制，Fotopoulos G等[25]采用M细胞模型，研究了与HIV感染相关的细胞受体，结果表明，无论是X4型(能够诱导合胞体形成)还是R5型(不能诱导合胞体形成)HIV毒株均能引起M细胞表达半乳糖神经酰胺酶和一定量的趋化性受体分子，并且证明了人肠道PP结中的滤泡相关上皮能够表达Galcer受体(一种CD4分子的替代物)和CCR5受体(HIV R5毒株的特异性趋化因子)，这些研究进一步扩充了人们对HIV致病机制的认识。Gonzalez-Hernandez M B等[26]采用极化的小鼠肠上皮细胞构建了M样细胞模型，并利用该模型研究了诺如病毒(Norwalk viruses)入侵肠道的机制，结果发现，诺如病毒在跨M样细胞转运过程中未出现复制现象，而且M样细胞之间的紧密连接也未遭到破坏。该研究同时发现，该M样细胞能够表达IgA受体，更有趣的是，当把以上小鼠肠上皮细胞与骨髓瘤细胞共培养时，其中的M样细胞的数量并未增加，但增强了其跨膜转运的活性，这些研究证实了鼠的诺如病毒能够巧妙利用肠道M细胞的跨膜通道突破完整的肠道黏膜屏障，这可能是该病毒入侵宿主的潜在机制。Donaldson D S等[27]证实了肠道上皮中的M细胞是朊病毒经口感染的重要门户，且机体对朊病毒的易感性与肠上皮中M细胞的分布密度相关。研究病原体如何选择性利用M细胞突破黏膜屏障入侵动物机体，将有助于我们对病原体致病机制的认识，同时也为我们开发黏膜药物及研制以M细胞为靶向的新型疫苗奠定重要的理论基础。

3 M细胞在兽医领域的研究

兽医领域对于M细胞的研究相对较少。Kato A等[28]发现鸡的盲肠扁桃体上皮存在M细胞，其形态与哺乳动物的M细胞相似，但缺乏对外源性抗原物质的吸收能力。Gebert A等[29]通过免疫组化试验证实，与其他动物的肠上皮细胞不同，猪的肠道M细胞能特异性表达Cytokeratin 18(CK18)蛋白，可以作为标志物用于猪肠道M细胞的鉴定，且这些M细胞主要分布在猪的小肠绒毛上皮。Li R F等[30]通过形态学、免疫荧光及免疫组化等方法证实新生仔猪小肠远离圆顶区的绒毛上皮也存在M细胞，这些M细胞在绒毛的不同部位呈异质性分布，即沿隐窝至绒毛顶端上皮方向，M细胞数量呈现逐渐减少的趋势，而且回肠绒毛M细胞的比例高于十二指肠和空肠，其形态在电镜下大多呈典型的“口袋状”结构，而十二指肠和空肠绒毛M细胞主要呈柱状。进一步研究证实，自然感染猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的仔猪小肠绒毛M细胞病变明显，胞浆中观察到成团的PEDV粒子，而相邻的其他上皮细胞中没有病毒粒子存在，提示仔猪小肠绒毛M细胞可能与PEDV的入侵有关[31]。以上研究为阐明PEDV的入侵机制奠定了基础，但对于小肠绒毛M细胞在PEDV入侵中的作用机制仍需开展更加深入研究，特别是弄清PEDV入侵M细胞的途径以及寻找M细胞中与PEDV入侵相关的关键分子，将为进一步认识PEDV如何突破猪肠道黏膜屏障的机制提供重要参考。

4 展望

尽管M细胞在许多病原体入侵中的作用已经得到证实，以M细胞为靶向的新型黏膜疫苗也正成为研究热点[32]，但有关M细胞仍存在许多问题亟待解决，包括：①有关肠道M细胞的分化目前仍存在争议。一种观点认为，肠道M细胞可能由位于小肠隐窝FAE一侧的独特细胞系分化而来，其分化程序不同于肠道中的其他上皮细胞；另一种观点认为，肠道中的M细胞分化自FAE中的肠上皮细胞，这类肠上皮细胞通过与淋巴细胞接触或受其释放的细胞因子刺激作用分化为M细胞。以上两种假说仍有待进一步证实。②尽管有关M细胞在病原入侵以及黏膜免疫方面的功能已经得到证实，但对于M细胞发挥以上功能的分子机制仍不清楚，特别是弄清M细胞表达识别受体的特异性，以及细胞内哪些信号分子参与了病原入侵和抗原转运及其调控机制等问题，将有助于进一步拓展对M细胞功能的认识。③当前关于M细胞在病原体入侵黏膜方面的作用研究较多，但对于M细胞在正常的肠道自稳中发挥的作用仍缺乏研究，开展此类研究的最好方法是构建M细胞缺失或其受体分子敲除模型，相信随着CRISPR/Cas9等先进的基因编辑技术出现，M细胞局部或系统性缺失动物模型将很快实现。④尽管当前已有M细胞体外模型的报道(Caco-2与B淋巴细胞共培养或用RANKL刺激小肠隐窝促使其分化)，但这些方法操作较为繁琐且不够稳定。因此，仍然需要构建更为简便、可靠的M细胞体外培养模型。特别是在兽医领域，由于M细胞的种属差异性，更加需要建立源自本动物(如猪、鸡和犬等)的体外M细胞模型用于动物病原体入侵机制方面的研究。

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ProgressonMCellsandRolesduringPathogenInvasions

LI Ren-feng, WANG Zi-liang, ZHAO Kun, WANG Li-rong, ZHANG Shou-ping, WANG San-hu

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,HenanInstituteofScienceandTechnology,Xinxiang,Henan,453003,China)

M cells, also known as microfold cells or membranous cells, are important epithelial cells that make up the mucosal immune barrier and play important role in mucosal immunity and pathogen invasions.In this paper,the morphology,function and the role of M cells during pathogen invasions were reviewed in order to extend the understanding of M cells and follow M cells research with interest in veterinary field.

M cell;mucosal immunity;pathogen invasion

2017-03-23

河南省基础与前沿项目(132300410014)；河南省高等学校重点科研项目(18A230004)

李任峰(1976-)，男，河南驻马店人，博士，实验师，主要从事兽医病原学及免疫学研究。*

S852.4

:A

:1007-5038(2017)09-0105-04