纳米标记物新型免疫检测技术研究进展

刘亚东，王慧煜，韩雪清

(中国检验检疫科学院动物检疫研究所，北京 100029)

纳米标记物新型免疫检测技术研究进展

刘亚东，王慧煜，韩雪清*

(中国检验检疫科学院动物检疫研究所，北京 100029)

纳米标记物新型免疫检测技术是近年来广泛应用于各个领域且发展迅速的一种简便、精准的现场检测技术，逐步推动着分子生物学的发展及人畜疾病的防控，成为了生物分析领域的重要内容，与之密切相关的纳米材料标记物在检测技术中起着主导作用。由于各种新型的纳米材料标记物的不断研发与优化分析，使得与之相关的检测技术广泛运用于食品质量检测、检验检疫、疾病防控等方面。随着生物分析领域的拓展，更多的标记物如纳米磁珠、镧系元素、上转换发光颗粒、纳米乳球、量子点等已被制备并应用于更多疾病诊断技术中。论文以结合近年来成功研究为基础归纳新型纳米材料标记物的特性方面的研究进展，剖析其多元性，以期为相关研究提供参考。

新免疫检测技术；纳米标记物；纳米磁珠；量子点

近年来，由于纳米科学技术的巨大发展，纳米科技在环境保护、生物医学、化学工艺等领域中的研究起到了根本性变革作用。新型纳米材料标记物的研制也日新月异，其应用于纳米标志免疫检测技术中正朝着高灵敏度、多元化、实现定量或半定量检测方向发展，一改往日灵敏度偏低、检测指标单一等缺点。目前新型的纳米材料标志物在研究领域广为知晓，如纳米磁珠、镧系元素、上转换发光颗粒、纳米乳球及量子点等。现对几种新型纳米标记的免疫检测技术的应用特性及优缺点进行剖析。

1 磁性纳米颗粒

磁性纳米颗粒是由Senyei A E于1978年开发出的一种备受科研工作者关注的新型材料[1]。磁性纳米颗粒(magnetic nanoparticles，MNs)被称为超顺磁颗粒，结合了纳米材料和磁性粒子的优点，具有超顺磁性、比表面积大及小尺寸效应等特点。由于纳米磁珠的强磁性和单分散性，应用在免疫层析技术中可大大提高检测分析的稳定性、灵敏度和可重复性。同时因其固有的纳米颗粒表面效应及磁性，已广泛用于药物载体、影像诊断、磁靶向及热疗等多项领域[2-3]。

磁性免疫层析技术是将纳米磁珠的磁信号与免疫层析技术相结合，使免疫层析技术向定量化、高灵敏度、多元化检测等方向发展，现已广泛地应用于生物检验检疫、食品质量监测等领域。孙建斌等[4]研发了用于早孕检测的人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin,HCG)纳米磁性免疫层析试纸条，检测快速且灵敏度高。Liu Chunyan等[5]研制出快速半定量检测对氧磷农药残留免疫层析试纸条，最低限度检测为1.7 ng/mL。吕品雷等[6]选用荧光磁性纳米粒子作为标记物，体外标记人脂肪间充质干细胞，结果显示被标记的人脂肪间充质干细胞具有很好的成像效果，为脂肪间充质干细胞的移植转化研究提供新方法。梁龙辉等[7]基于相思子毒素磁性纳米颗粒免疫捕获法的建立，与建立的双夹心ELISA相比较，灵敏度得到了显著的提高，于此适用于微量相思子毒素的检测分析。由于可应用的高纯度MNs的制备还处于困难时期，磁性号的检测灵敏不及光信号，且检测仪器无法小型化不便携带操作，若将该因素有效规避，那么该方面的研究将大放异彩。

2 斓系元素

Soini E等[8]在1983年首次将镧系离子标记为示踪螯合物引入到免疫分析领域，使镧系元素(Lanthanide,Ln)和其螯合物在免疫层析检测技术中得到广泛应用。Ln是一种具有上转换发光特性的金属稀土元素，并有高化学稳定性、发光强度高且稳定及毒性低等优点，是一类拥有广阔应用前景的新型发光生物标记纳米材料[9]。镧系元素与普通荧光相比其具有荧光衰变时间长、Stokes位移大和发射光谱窄等优点。以镧系元素及其螯合物为标记物应用到免疫分析技术中，成为目前超微量物质分析中最有发展前途的技术之一[10]。

目前，应用最广泛的解离增强镧系荧光免疫分析(dissociation enhanced lanthanide fluoroimmunoassay,DELFIA)技术就是基于镧系元素的优点研发而来的。相关的研究如辛甜甜等[11]基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测日本鳗鲡的嗜水气单胞菌的研究中，证明了基于纳米粒子时间分辨免疫荧光法在颗粒性抗原检测中的可行性。Juntunen E等[12]使用一种包埋铕的聚苯乙烯纳米微球作为标记物的免疫层析技术进行生物亲和性分析研究，在前列腺特异性抗原试验结果发现铕纳米微球的荧光检测的灵敏度高于胶体金法300倍。但现在斓系掺杂发光纳米微粒的研究仍处于初级阶段，对其表面功能化和生物相容性的研究较少，且其合成工艺尚未成熟，因此其在生物学领域的应用中仍存在一定的局限。

3 上转换发光颗粒

上转换发光颗粒(up-converting phosphor,UCP)于20世纪90年代开始用于生物分子标志物，是由两种不同斓系元素离子掺杂于晶体中构成的一类可将红外光上转换为可见光的特殊纳米材料[13]。UCP具有“低能光激发、高能光发射”的上转发光特征，并具备高稳定性、高敏感性、简便及安全等优点，可适用于定量和多重分析，在实验室或野外现场均可使用[14]。

上转发光免疫层析(up-converting phosphor technology based lateral-flow assay,UPT-LF)是近年来新兴的将上转发光技术(up-converting phosphor technology，UPT)与传统免疫层析技术相结合的一种快速检测技术，可以实现稳定、灵敏、定量和无背景干扰的检测[15]，该技术已广泛应用于疾病诊断、药品检测等多种领域。与此同时，近年来以上转发光纳米颗粒作为生物示踪物的上转发光免疫层析技术的兴起，使得传统免疫层析的灵敏性、定量能力有了显著提升[16-17]。李春凤等[18]基于上转发光转发光免疫层析技术对于常见的4种食源性致病菌建立了快速检测的方法，结果表明建立的快速检测方法简便快速，具有良好的敏感性、特异性和线性定量能力，操作性能可满足食品安全检测的要求。雷皖秋[19]利用该法定量检测血液中的HBsAg，结果显示其灵敏度为0.5 IU/mL，特异性为100%，但敏感性只有76.92%。UCP颗粒自问世及发展以来，应用研究进展迅速，是目前免疫层析中应用的标记物的热点，但UCP颗粒需修饰活化后才能用于标记，且成本高，仍需要继续探索和研究。

4 纳米微球

Armes S P等[20]在20世纪80年代末初次合成了导电的CPANi水基乳胶溶液，通过采用新的聚合工艺技术制备纳米导电聚苯胺乳胶微球。乳胶纳米颗粒作为第一个被用于层析试纸条标记的探针，在免疫层析试纸技术中得到了有效的应用。杨煌建等[21]通过采用聚合物纳米微球分离纯化放线菌素D的研究发现，纳米微球作为层析填料的分离纯化工艺，其纯度与收率都较高，流程简单、可行，为该产品产业化开发奠定基础。赵京伟等[22]研发了以荧光纳米颗粒为标记物用于检测O139群霍乱弧菌的免疫层析试纸条，检测灵敏度为3.5×104CFU/mL。虽然纳米微球在ICTSs标记中处于与胶体金相媲美的地位，但仍存在灵敏度不高等问题，还需进一步研究和改进。

5 量子点

量子点(quantum dots,QDs)也称荧光半导体纳米颗粒，其研究始于上世纪80年代，作为新兴的荧光探针当前已广泛应用生物领域。如近年来的量子点免疫层析试纸条、免疫磁珠分离量子点多重免疫荧光分析、量子点荧光能量共振转移、量子点标记生物传感等[23]。Bruno J G[24]建立了高亲和性的DNA适配体偶联量子点侧向层析试纸条方法，用于单增生李斯特菌、沙门菌和大肠埃希菌的检测，其灵敏度高于胶体金试纸条。Liu J等[25]通过EDC/NHS方法将CdTe量子点与氰戊菊酯单克隆抗体偶联，建立检测水及蔬菜中氰戊菊酯残留的dcFLSA，该方法LOD达到25 ng/mL。虽然量子点用于生物标记中具有很多优势，但仍存在如量子点与生物分子的连接工艺不成熟、标记的QDs种类较少及检测设备要求高等问题。

6 其他

近年来，碳纳米颗粒(carbon nanoparticles，CNPs)已成为继胶体金、乳胶颗粒等之后的重要 ICTSs 标记物[26]，其原理与胶体金相似，在应用方面取得了很大的进展，研究重点正转向大规模生产和应用领域。研究表明，CNPs比传统的胶体金及乳胶颗粒更灵敏。但CNPs在免疫标记中仍存在标记时间长、无法进行多元检测等不足，此问题若得以解决，必使碳纳米颗粒的应用大放异彩。

荧光素衍生物是一种已广泛应用于免疫层析技术中的标志物，如异硫氰酸酯荧光素(luoresceinisothiocyanate，FITC)[27]。目前，由于有机纳米粒子的荧光发射依靠于本身的化学发光集团，不具备可调控的尺寸效应，该不足使它们在应用上存在一些如灵敏度低、化学稳定性差等问题，故正在被新型的标志物所替代。

7 结语

近年来，各种新型纳米标记物的不断出现，有效地促进了层析试纸条技术的快速发展。但这些新型纳米标记物仍存在一些不足，需继续研究探索，为新型纳米材料试纸条的研发提供新的思路，相关的研究逐步深入并积极开展。总之，免疫层析试纸条检测技术已渗透进入生物医学、化学等各领域。相信通过免疫层析试纸条检测技术的原理及条件的不断优化和改进，使之在生物检测中有更广泛的应用和发展。

[1] Widder K J,Senyei A E,Ovadia H,et al.Magnetic protein A microspheres:a rapid method for cell separation[J].Clin Immunol Immunopathol,1979,14(3):395-400. [2] 郑 静,程圭芳,冯婉娟,等.纳米金和磁性纳米颗粒在生物传感器中的应用[J].化学世界,2010,5(5)：310-313.

[3] 房 坤,杨 芳,顾 宁.携带磁性纳米颗粒载药微囊的制备及肿瘤治疗的应用研究进展[J].中国肿瘤临床,2014(1):9-12.

[4] 孙建斌,雷小英,包 晗,等.纳米磁性颗粒标记的免疫层析法定量检测人绒毛膜促性腺激素[J].现代生物医学进展,2011,24(11):5001-5004.

[5] Liu Chunyan,Jia Qiaojuan,Yang Chunhui,et al.Lateral flow Immunochromatographic assay for sensitive pesticide detection by Using Fe3O4nanoparticle aggregates as color reagents[J].Trends Analyt Chem,2011,83(17):6778-6784.

[6] 吕品雷,苏约翰,崔大祥,等.荧光磁性纳米粒子标记三维培养系统中的脂肪间充质干细胞[J].中国组织工程研究,2015,19(1):44-48.

[7] 梁龙辉,刘石磊,高 川,等.相思子毒素磁性纳米颗粒免疫捕获法的建立[J].细胞与分子免疫学杂志,2014,30(10):1095-1098.

[8] Soini E，Kojola H.Time-resolved fluorometer for lanthanide chelates-a new generation of nonisotopic immunassays[J].Clin Chem，1983,29:65-68．

[9] 徐晓巍,崔正权,卢 瑛,等.基于磁性纳米探针的乙肝前S1抗原的快速磁性免疫层析方法的建立[J].生物学杂志,2016,33(1):98-103.

[10] 梁荣良，吴英松.镧系元素在免疫学检测技术中的应用[J].现代免疫学，2015(4):348-352.

[11] 辛甜甜,王艺磊,冯建军,等.基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测日本鳗鲡的嗜水气单胞菌[C].中国水产学会，2015.

[12] Juntunen E,Myyrylainen T,Salminen T,et al.Performance of fluorescent europium(III)nanoparticles and colloidal gold reporters in lateral flow bioaffinity assay[J].Anal Biochem,2012,428:31-38.

[13] Zijlmans H J,Bonnet J,Burton J,et al.Detection of and tissure surface antigens using up-converting phosphors:a new reporter t-echnology[J].Anal Biochem,1999,267(1):30-36.

[14] Corstjens P L,Li S,Zuiderwijk M,et al.Infrared up-converting phosphors for bioassays[J].IEE Proc Nanobiotechnol,2005,152(2):64-72.

[15] 周 蕾,纪 军,杨瑞馥.上转磷光技术在快速生物分析中的应用[J].生物技术通报,2003(3):20-25.

[16] Zhang P,Liu X,Wang C,et al.Evaluation of up-converting phosphor technology-based lateral flow strips for rapid detection ofBacillusanthracisspore,Brucellaspp.andYersiniapestis[J].PLoS One,2014,9(8):e105305-e105305.

[17] Li C,Zhang P,Wang X,et al.Development and comparative evaluation of up-converting phosphor technology based lateral flow assay for rapid detection ofYersiniapestis,Bacillusanthracisspore andBrucellaspp.[J].Zhonghua Yufang Yixue Zazhi,2015,49(1):3-8.

[18] 李春凤,赵 勇,王晓英,等.基于上转发光免疫层析技术的常见食源性致病菌快速检测方法研究与评价[J].军事医学,2015,39(2):128-132.

[19] 雷皖秋.上转发光免疫层析法定量测定HBsAg试剂条在血液筛检中的应用[J].临床输血与检验,2012,14(2):124-128.

[20] 赵京伟,李 京. 导电聚苯胺乳胶纳米微球材料研究进展[J]. 化工新型材料,2002(10):11-16.

[21] 杨煌建,张祝兰,王德森,等.聚合物纳米微球分离纯化放线菌素D的研究[J].天然产物研究与开发,2016(1):46-49.

[22] 赵京伟,李 京. 导电聚苯胺乳胶纳米微球材料研究进展[J]. 化工新型材料,2002(10):11-16.

[23] Kim G,Moon J H,Moh C Y,et al.A microfluidic nano-biosensor for the detection of pathogenic Salmonella[J].Biosensors & Bioelectronics,2015,67:243-247.

[24] Bruno J G.Application of DNA aptamers and quantum dots to lateral flow test strips for detection of foodborne pathogens with improved sensitivity versus colloidal gold[J].Pathogens,2014,3(2):341-355.

[25] Liu J,Zhang Q,Zhang W,et al.Development of a fluorescence-linked immunoassay based on quantum dots for fenvalerate[J].Food Agr Immunol,2014,25(1):82-93.

[26] Li Y,Kim W,Zhang Y,et al.Growth of single-walled carbon nanotubes from discrete catalytic nanoparticles of various sizes[J].J Phys Chem B,2016,105(46):11424-11431.

[27] Feng Y,Liu L,Hu S,et al.Efficient fluorescence energy transfer system between fluorescein isothiocyanate and CdTe quantum dots for the detection of silver ions[J].Luminescence,2016,31(2):356-363.

Abstract:The new nano marker immunoassay technology is one of the point-of-care test technology rapidly developed and has widely applied in various fields in recent years,which gradually promotes the development of molecular biology and prevention and control of human and animal diseases,and has become the important contents in the field of bio-analysis.And the closely related nanomaterial markers are playing a leading role in the tests.With the development and optimization analysis of various new nano material markers, the detection technology is widely used in food quality inspection, inspection and quarantine, disease prevention and control so on. With the expansion of the field of bioanalysis, more markers such as magnetic nanoparticles, lanthanide, up-converting phosphor, nanospheres, quantum dots and so on have been prepared for use in more disease detection techniques.Based on the recent successful research, the principle and the development of several nano-bio-markers, and analysis of its diversity were briefly reviewed to provide effective reference for the related research.

Keywords:new immunoassay technology; nano-material biomarker; magnetic nanoparticle;quantum dot

ProgressonNewNanoMarkerImmunoassayTechnology

LIU Ya-dong,WANG Hui-yu,HAN Xue-qing

(AnimalQuarantineInstituteofChineseAcademyofInspectionandQuarantine，Beijing,100029，China)

S852.4

A

1007-5038(2017)08-0093-04

2017-01-18

国家重点研发计划项目(2016YFD0500908)；公益性行业科研专项(201510017)

刘亚东(1991-)，女，河南周口人，硕士研究生，主要从事动物疫病防治与兽医公共卫生学研究。*