烟曲霉孢子对肥大细胞活化作用的研究

陈丽莎 李燕明 佟训靓 赵作涛 王辰,5

(1.北京大学中日友好临床医学院，北京 100029；2.北京医院呼吸与危重症医学科，北京 100730；3.北京医院老年医学部，北京 100730；4.北京大学第一医院皮肤性病科 北京大学真菌和真菌病研究中心，北京 100034；5.国家呼吸疾病临床研究中心 中日友好医院呼吸中心 中日友好医院呼吸与危重症医学科，北京 100029)

·论著·

烟曲霉孢子对肥大细胞活化作用的研究

陈丽莎1李燕明2佟训靓3赵作涛4王辰1,5

(1.北京大学中日友好临床医学院，北京 100029；2.北京医院呼吸与危重症医学科，北京 100730；3.北京医院老年医学部，北京 100730；4.北京大学第一医院皮肤性病科 北京大学真菌和真菌病研究中心，北京 100034；5.国家呼吸疾病临床研究中心 中日友好医院呼吸中心 中日友好医院呼吸与危重症医学科，北京 100029)

目的 研究烟曲霉孢子对人肥大细胞系HMC-1的活化作用。方法 用加热灭活的方法制备烟曲霉孢子抗原，体外培养人肥大细胞系HMC-1细胞，检测热灭活烟曲霉孢子诱导HMC-1细胞脱颗粒β-氨基己糖苷酶释放比，酶联免疫吸附测定 (ELISA)法检测HMC-1细胞培养上清中白细胞介素-5 (IL-5)的释放，Realtime-PCR检测热灭活烟曲霉孢子诱导的HMC-1细胞IL-5 mRNA的表达变化。结果 与阴性对照组相比，热灭活烟曲霉孢子刺激后HMC-1细胞的β-氨基己糖苷酶释放比升高[(11.3%±1.2%)VS(0.5%±0.1%)，P<0.05]，IL-5释放增加[(11.96±1.09)VS(9.00±1.36)，P<0.05]，IL-5 mRNA表达上调[(2.47±0.12)VS(0.00±0.26)，P<0.05]。结论 热灭活烟曲霉孢子诱导HMC-1肥大细胞活化，引起细胞活化脱颗粒、合成和释放IL-5增加。

烟曲霉；孢子；肥大细胞；脱颗粒；白细胞介素-5

烟曲霉是自然环境中广泛存在的条件致病真菌，其产生的气传孢子，可被吸入呼吸道末端，引起曲霉致敏相关的疾病，例如过敏性哮喘、过敏性肺炎、变应性支气管肺曲霉病 (Allergic bronchopulmonary aspergillosis，ABPA)等疾病。同时环境中烟曲霉孢子浓度升高与疾病症状加重密切相关，如高浓度的烟曲霉孢子与哮喘症状加重和病死率升高具有相关性[1]，体内实验已证实烟曲霉孢子暴露可以引起哮喘模型大鼠气道高反应性和气道炎症加重[2]。肥大细胞是重要的效应和调节性免疫细胞，可以脱颗粒释放组胺等炎症介质、合成并释放细胞因子和趋化因子等，与变态反应性疾病如过敏性哮喘、荨麻疹等关系密切。目前已知烟曲霉含有23种抗原成分[3]，可以诱导机体产生特异性IgE并与之共同结合在肥大细胞表面的IgE受体上，诱导肥大细胞脱颗粒。近几年的研究发现，肥大细胞还可以通过多种非IgE依赖活化途径参与真菌致敏的免疫调节[4]，白念珠菌、申克孢子丝菌等真菌均被发现可以通过非IgE依赖途径活化肥大细胞[5-6]，引起肥大细胞脱颗粒或合成并释放相关细胞因子。体外实验发现烟曲霉菌丝可以直接诱导肥大细胞脱颗粒[7]，提示肥大细胞除经典的IgE途径外，还存在非IgE依赖的活化通路参与烟曲霉致敏的免疫调节过程。本实验通过研究加热灭活的烟曲霉孢子抗原对肥大细胞的活化作用，增加对肥大细胞在烟曲霉致敏时免疫调节功能的认识。

1 材料与方法

1.1 菌株

烟曲霉 (Aspergillusfumigatus)AF293，由北京大学真菌与真菌病研究中心提供。

1.2 试剂

4-硝基苯-N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷 (4-Nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide，美国Sigma公司)，钙离子载体A23187 (Calcium ionophore A23187,比利时Acros公司)。沙氏葡萄糖琼脂 (英国Oxoid公司)。细胞培养用IMDM培养基、1640培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素购自美国Gibco公司。RNA提取试剂盒 (美国Omega公司)、逆转录试剂盒 (日本Takara公司)、SYBR Green PCR Master Mix (美国Invitrogen公司)、人IL-5 ELISA试剂盒 (美国RayBiotech公司)。

1.3 细胞培养

人肥大细胞系HMC-1，购自上海酶研生物科技有限公司。HMC-1细胞于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的IMDM培养基中，放于37℃、饱和湿度、5%CO2细胞培养箱中培养。每3～4 d传代，细胞密度维持在2×105～1×106/mL之间。

1.4 烟曲霉孢子抗原的制备

参照文献[8]，用加热法制备灭活的烟曲霉孢子抗原：(1)烟曲霉AF293接种在沙氏琼脂糖培养基 (SAD)35℃培养5 d。(2)0.01%吐温80生理盐水冲洗培养基表面收集烟曲霉分生孢子，通过8层无菌纱布过滤除去菌丝，将孢子悬液3 000 g×10 min离心，重悬于无菌PBS缓冲液中。(3)将烟曲霉孢子计数后接种至无血清的1640培养基中，35℃恒温摇床100 r/min，摇菌8 h。(4)收取孢子，镜下观察确认孢子肿胀以更加充分暴露抗原，3 000 g离心10 min，重悬于无菌PBS缓冲液中，光学显微镜下血球计数板计数，调整孢子悬液浓度为1×108/mL。(5)孢子悬液放入100℃金属浴中加热1 h，制成灭活烟曲霉孢子抗原，保存于-80℃备用。(6)接种100 μL的灭活孢子悬液于沙氏琼脂糖平皿中，27℃培养10 d确保孢子全部灭活。

1.5 β-氨基己糖苷酶释放试验

β-氨基己糖苷酶释放试验是反映肥大细胞脱颗粒程度的经典试验之一。方法参照Romo-Lozano等人[6]研究。取对数生长期的HMC-1细胞，台盼蓝染色后显微镜下检查细胞活力大于95%，细胞重悬在未添加血清、抗生素的无酚红IMDM培养液中，接种于96孔中 (密度1×106/mL)，每孔100 μL，设阴性对照组、阳性对照组 (A23187，20 μmol/L)、HKAFS组 (热灭活烟曲霉孢子，5×105/mL)，每组3个复孔。HMC-1细胞与A23187、HKAFS于37℃细胞培养箱中共孵育3 h后，离心留取细胞培养上清液和细胞沉淀。细胞沉淀在含0.1%TritonX-100的无血清、抗生素及酚红的IMDM培养液中充分裂解后离心留取上清为细胞裂解液。培养上清液和细胞裂解液各取40 μL加入96孔板中，加40 μL葡萄糖苷柠檬酸溶液 (2 mmol/L 4-硝基苯-N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷+62.5 mmol/L柠檬酸一水合物+100 mmol/L无水磷酸氢二纳，pH=4.5)，37℃孵育1 h后加入100 μL甘氨酸液 (0.2 mol/L甘氨酸，pH=10.7)终止反应，酶标仪测定405 nm波长处各孔反应液的吸光度。β-氨基己糖苷酶释放比表示为：β-氨基己糖苷酶释放比 (%)=(培养上清液OD405-本底液OD405)/(培养上清液OD405+细胞裂解液OD405-本底液OD405)×100%。

1.6 ELISA法检测IL-5细胞因子释放

取对数生长期、细胞活力大于95%的HMC-1细胞，细胞重悬在含10%胎牛血清的IMDM培养液中，细胞接种浓度、热灭活烟曲霉孢子刺激浓度同前，共孵育6 h后，按ELISA试剂盒说明书检测细胞培养上清液IL-5释放水平。

1.7 Realtime-PCR检测IL-5mRNA表达

取对数生长期、细胞活力大于95%的HMC-1细胞，细胞重悬在含10%胎牛血清的IMDM培养液中，接种于24孔板中 (细胞密度1×106/mL)，设阴性对照组、HKAFS组 (孢子浓度1×106/mL)，每组3个复孔,共孵育3 h后，收集细胞提取总mRNA，用于Realtime-PCR检测。Realtime-PCR IL-5 (73 bp)上游引物：AAGAGACCTTGGCACTGCTTTC，下游引物：GGAACAGGAATCCTCAGAGTCTCA。采用GAPDH (104 bp)为内参，上游引物：AAGATCATCAGCAATGCCTCC，下游引物：TGGACTGTGGTCATGAGTCCTT。采用ABI prism 7500 PCR仪 (Applied Biosystems)检测IL-5 基因的表达，结果使用相对定量2-ΔΔCt法[9]计算分析。

1.8 统计学方法

2 结 果

2.1 加热灭活烟曲霉孢子形态及验证灭活

收集烟曲霉肿胀孢子100℃加热灭活制成灭活烟曲霉孢子抗原，光学显微镜下观察烟曲霉孢子加热前后无明显形态改变，孢子结构未见明显破坏 (见图1)。接种加热灭活烟曲霉孢子悬液于沙氏琼脂糖平皿中，25℃培养10 d后未见烟曲霉菌落生长 (见图2a)，加热灭活烟曲霉孢子与HMC-1细胞在完全IMDM培养液中37℃共培养24 h，未见烟曲霉菌丝生长 (见图2b)，验证了烟曲霉孢子被灭活，排除烟曲霉孢子生长感染细胞干扰实验结果。

2.2 烟曲霉孢子引起HMC-1细胞β-氨基己糖苷酶释放增加

将热灭活的烟曲霉孢子和阳性对照物A23187与HMC-1细胞共孵育3 h后，检测β-氨基己糖苷酶释放比，A23187组、HKAFS组比阴性对照组明显增高，结果差异具有统计学意义 (11.3%±1.2%、6.1%±0.7% VS 0.5%±0.1%，P<0.05)，A2318组比HKAFS组高，结果差异具有统计学意义 (11.3%±1.2% VS 6.1%±0.7%，P<0.05)，说明A23187和热灭活烟曲霉孢子均能够引起HMC-1细胞脱颗粒，热灭活烟曲霉孢子诱导的细胞脱颗粒程度低于阳性对照刺激物A23187，热灭活烟曲霉孢子不是肥大细胞脱颗粒的强诱导物。结果见图3。

2.3 热灭活烟曲霉孢子促进HMC-1细胞释放IL-5

将热灭活烟曲霉孢子与HMC-1细胞共孵育6 h后，用ELISA法检测细胞培养上清中IL-5释放程度，结果如图4所示，HKAFS组明显高于阴性对照组，结果差异具有统计学意义 (11.96±1.09 ng/mL VS 9.00±1.36 ng/mL,P<0.05)，提示热灭活烟曲霉孢子能够促进HMC-1细胞释放IL-5。

2.4 热灭活烟曲霉孢子引起HMC-1细胞IL-5 mRNA表达上调

将热灭活烟曲霉孢子与HMC-1细胞共孵育3 h，Realtime-PCR法检测细胞IL-5 mRNA的相对表达量，结果如图5所示，HKAFS组基因相对表达量较阴性组显著升高，结果差异具有统计学意义 (2.47±0.12 VS 0.00±0.26,P<0.05)，说明热灭活烟曲霉孢子诱导HMC-1细胞IL-5基因表达上调。

3 讨 论

烟曲霉是常见的致敏真菌，哮喘患者约有16%～38%的患者对曲霉皮肤试验阳性，其中烟曲霉致敏占97%[10]，烟曲霉致敏在重症哮喘中发生率高达51%。烟曲霉与哮喘症状加重有关，临床研究发现环境中烟曲霉孢子浓度升高与哮喘症状加重和病死率升高相关，烟曲霉致敏加重肺功能受损[1]，体内实验显示吸入烟曲霉孢子可以加重卵清蛋白 (Ovalbumin，OVA)致敏哮喘模型大鼠的气道炎症和气道反应性[2]。然而烟曲霉孢子暴露加重哮喘症状的机制尚不明确。

肥大细胞是速发型变态反应的初级效应细胞，其活化同时影响次级效应细胞例如嗜酸性粒细胞等的募集与激活。肥大细胞活化可以通过多种方式被诱发，IgE依赖的免疫机制是其脱颗粒的主要方式。近年来大量研究显示肥大细胞还存在多种非IgE依赖活化途径,例如Toll样受体、C型凝集素受体、补体受体等受体，可以与相应物质结合后诱导肥大细胞活化，参与真菌致敏的免疫调节过程[4]。白念珠菌的酵母和菌丝可以通过Dectin1受体通路诱导肥大细胞脱颗粒、合成和释放多种细胞因子[5]，申克孢子丝菌孢子直接引起肥大细胞释放细胞因子并增加其组胺的释放潜能[6]。肥大细胞的非IgE依赖活化途径在真菌致敏中发挥了重要免疫调节作用。

图1 100×10倍光学显微镜下烟曲霉孢子形态 (a.未加热灭活的烟曲霉孢子,b.加热灭活烟曲霉孢子) 图2 验证加热烟曲霉孢子灭活 (a.加热灭活烟曲霉孢子接种于沙氏琼脂糖平皿中，25℃培养10 d后未见烟曲霉菌落生长；b.加热灭活烟曲霉孢子与HMC-1细胞在完全IMDM培养液中37℃共培养24 h，20×10倍光学显微镜下观察未见烟曲霉菌丝生长) 图3 HMC-1细胞β-氨基己糖苷酶释放比 (A23187.阳性对照组；HKAFS.加热灭活烟曲霉孢子组；A23187组、HKAFS组 VS 阴性对照组，A23187组 VS HKAFS组，*.P<0.05) 图4 ELISA法检测HMC-1细胞培养上清中IL-5水平 (HKAFS.加热灭活烟曲霉孢子组；HKAFS组 VS 阴性对照组，*.P<0.05) 图5 Realtime-PCR法检测HMC-1细胞IL-5 mRNA表达水平 (HKAFS.加热灭活烟曲霉孢子组；HKAFS组 VS 阴性对照组，*.P<0.05)

Fig.1 The morphology ofAspergillusfumigatusspores observed by optical microscope (Optical magnification 100×10;a.naturalAspergillusfumigatusspores;b.heat-killedAspergillusfumigatusspores) Fig.2 Inactivation of heat-killedAspergillusfumigatusspores (a.Planting the heat-killedAspergillusfumigatusspores on SAB in 25℃ temperature for 10 days,no colonies grew on the plate;b.Heat-killedAspergillusfumigatusspores and HMC-1 were co-cultured in complete IMDM medium in 37℃ for 24 hours,no hyphae were observed under the 200× optical microscope) Fig.3 The release of β-hexosaminidase by HMC-1 (A23187.positive control group,HKAFS.heat-killedAspergillusfumigatusspores group;A23187,HKAFS VS Control，A23187 VS Control，*.P<0.05) Fig.4 Supernatants IL-5 levels measured by ELISA (HKAFS.heat-killedAspergillusfumigatusspores group;HKAFS VS Control,*.P<0.05) Fig.5 The expression of IL-5 mRNA on HMC-1 by Realtime-PCR (HKAFS.heat-killedAspergillusfumigatusspores group;HKAFS VS Control,*.P<0.05)

2009年Mirjam等[7]发现成熟的烟曲霉菌丝可以通过非IgE依赖途径直接接触肥大细胞引起肥大细胞脱颗粒，首次发现了烟曲霉通过非IgE依赖途径活化肥大细胞，但作用的具体机制并不明确，也未说明烟曲霉孢子的对肥大细胞的活化作用。本研究探讨烟曲霉孢子抗原对肥大细胞的直接活化作用，参照文献[8]方法，用加热的方法将烟曲霉孢子制成灭活的孢子抗原，以充分暴露孢子表面的抗原，同时避免烟曲霉孢子与细胞共孵育时继续萌芽生长成菌丝感染细胞干扰实验结果。在体外条件下将加热灭活烟曲霉孢子抗原与人肥大细胞系HMC-1共孵育，检测HMC-1细胞的β-氨基己糖苷酶释放比。β-氨基己糖苷酶释放比试验是检测肥大细胞脱颗粒程度的经典实验方法，本研究发现，在无特异性IgE存在的条件下，加热灭活烟曲霉孢子组的β-氨基己糖苷酶释放比的值显著高于阴性对照组 (P<0.05)，但略低于阳性对照组，说明加热灭活烟曲霉孢子抗原能够在一定程度上引起HMC-1细胞脱颗粒，但不是肥大细胞脱颗粒的强诱导物。此结果提示，烟曲霉孢子可能使肥大细胞活化并释放组胺、白三烯、类胰蛋白酶等炎症介质，从而引起并加重气道炎症，烟曲霉孢子暴露造成哮喘患者症状的急性加重，可能与烟曲霉孢子对肥大细胞的活化作用相关。

IL-5是引起哮喘症状的重要细胞因子之一。IL-5能够促进嗜酸性粒细胞的分化成熟，同时也是嗜酸性粒细胞的强趋化因子，与嗜酸性粒细胞炎症形成和嗜酸性粒细胞活化密切相关[11]。嗜酸性粒细胞及其合成释放的多种炎症介质与重症哮喘关系密切[12]，嗜酸性粒细胞显著升高是烟曲霉引起的变应性支气管肺曲霉病的主要特征之一[13]。研究显示，对嗜酸性粒细胞增多型哮喘患者，抗IL-5以及抗IL-5Ra治疗效果显著[14]。肥大细胞是IL-5的主要来源之一[15]，肥大细胞活化可能会通过其释放的IL-5促进嗜酸性粒细胞炎症形成，加重哮喘症状。本实验将热灭活的烟曲霉孢子与HMC-1细胞共孵育，用Realtime-PCR的方法检测HMC-1细胞IL-5 mRNA的表达，用Elisa法检测HMC-1细胞上清液中IL-5的释放水平，分别在基因转录和蛋白表达水平验证了加热灭活烟曲霉孢子抗原引起HMC-1细胞表达、释放IL-5增加。本研究提示，烟曲霉孢子诱导肥大细胞IL-5的释放，IL-5参与促进气道嗜酸性粒细胞浸润和炎症形成等生物学功能已经被证实，因此，烟曲霉孢子诱导肥大细胞的活化可能是整个致敏过程的始动因素。

此次实验结果初步验证了加热灭活烟曲霉孢子抗原能够直接活化HMC-1细胞，引起HMC-1细胞脱颗粒、合成并释放IL-5，证实了加热灭活烟曲霉孢子抗原能够经非IgE依赖途径活化肥大细胞，为认识烟曲霉和肥大细胞相互作用提供了实验支持。

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[本文编辑] 王 飞

Effects ofAspergillusfumigatusspore on the activation of mast cell

CHEN Li-Sha1,LI Yan-Ming2,TONG Xun-Liang3,ZHAO Zuo-Tao4,WANG Chen1,5

(1.PekingUniversityChina-JapanFriendshipSchoolofClinicalMedicine,Beijing100029;2.DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine,BeijingHospital,Beijing100730;3.DepartmentofGeriatrics,BeijingHospital,Beijing100730;4.DepartmemtofDermatovenerology,PekingUniversityFirstHospital,ResearchCenterforMedicalMycology,Beijing100034;5.NationalClinicalResearchCenterforRespiratoryDiseases,CenterforRespiratoryDiseases,China-JapanFriendshipHospital,DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine,China-JapanFriendshipHospital,Beijing100029)

ObjectiveTostudytheeffectsofAspergillus fumigatussporeontheactivationofhumanmastcelllineHMC-1.MethodsPreparedheat-killedAspergillus fumigatussporeantigenbyheatingmethod.HMC-1cellswereco-culturedwithheat-killedAspergillus fumigatussporeswhoseconcentrationwas5×105.Microplatespectrophotometerwasappliedtotheβ-hexosaminidasereleaseassaywhichwasanindexofmastcelldegranulation.Enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)wasusedforreleasedIL-5.TheexpressionlevelsofIL-5mRNAwasdetectedbyRealtime-PCR.ResultsComparedwiththenegativecontrolgroup,heat-killedAspergillus fumigatussporesincreasedβ-hexosaminidaserelease[(11.3%±1.2%)VS(0.5%±0.1%),P<0.05],IL-5mRNAexpressionlevel[(2.47±0.12)VS(0±0.26),P<0.05]andthereleaseofIL-5 [(11.96±1.09)VS(9±1.36),P<0.05]inHMC-1cells.ConclusionAspergillus fumigatussporesactivatesmastcelllineHMC-1resultingincelldegranulation,synthesisandreleaseofIL-5.

Aspergillus fumigatus;spore;mastcell;degranulation;interleukin-5

3-7]

国家十二五科技支撑计划 (2012BAI 05B02)

陈丽莎，女 (汉族)，硕士研究生在读.E-mail:lychenls@qq.com

王辰,E-mail:cyh-birm@263.net

R 379.6

A

1673-3827(2017)12-0003-05

2017-01-25