酶解法提取银杏叶多糖的初步研究*

张 琳，张 彦，仙 靓，张 寒，丁淑梅，汪兴军，申旭霁，刘文斌

(1.西安市中心医院，陕西 西安 710003；2.西安医学院 药学院，陕西 西安 710021；3.西安交通大学 药学院，陕西 西安 710065)

银杏叶为银杏科植物银杏(GinkgobilobaL.)的干燥叶，主要活性成分较为复杂，主要含有黄酮类、银杏内酯，此外还有银杏叶多糖、银杏酸、聚戊烯醇及微量元素等。其中，银杏叶多糖是一种重要的生物活性物质，具有降血糖[1]、抗肿瘤[2]等多种作用。虽有银杏多糖的提取研究报道，但通过酶解法来提取银杏多糖的研究较少见。作者比较传统水提法与酶解法提取银杏多糖的提取效率，考察酶解法提取银杏多糖的可行性。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

银杏叶：采自西安医学院未央校园，由生药教研室汪兴军老师鉴定为GinkgobilobaL.；D-无水葡萄糖：上海雅吉生物科技有限公司；浓硫酸：分析纯，西陇化工有限公司；蒽酮：分析纯，上海科丰化学试剂有限公司；乙醚：分析纯，利安隆博平医药化学有限公司；氯仿：分析纯，成都市科化化工试剂厂；正丁醇：分析纯，广东省化学试剂工程技术研究开发中心；纤维素酶：成都艾科达化学试剂有限公司。

高速万能粉碎机：FW100D-FW-1000AD，天津鑫博得仪器有限公司；电子天平：BSA224S，赛多斯科学仪器有限公司；电热恒温水浴锅：DZKW-S-6，北京市永光明仪器厂；循环水真空泵：SHZ-D，巩义市予华仪器有限公司；干燥箱：101-1，上海市实验仪器总厂；紫外可见分光光度仪：UV-160A，日本岛津有限公司；变换红外光谱仪：TENSOR27，德国布鲁克。

1.2 实验方法

1.2.1 试剂配制

葡萄糖标准溶液的配制：取葡萄糖标准品约0.025 0 g，精密称定，溶解并定容于250 mL容量瓶中。

蒽酮-浓硫酸：取蒽酮约0.2 g，精密称定，溶解于5 mL乙醇中，再于100 mL容量瓶中以质量分数75%硫酸定容至刻度，摇匀。

醋酸-醋酸钠缓冲溶液的配制(pH=4.5)：取醋酸钠约1.8 g，精密称定，置于100 mL容量瓶中，量取0.98 mL冰醋酸，用蒸馏水定容至刻度。

Sevag试剂的配制：量取氯仿40 mL，正丁醇8 mL，混匀。

碘-碘化钾的配制：取碘化钾约0.8 g，精密称定，置于烧杯中,加入2 mL水溶解，再精确称取碘0.1 g加入，待全部溶解，移至10 mL容量瓶中，定容至刻度。

淀粉指示液的配制：取淀粉约0.5 g，精密称定，用20 mL水溶解，量取80 mL水在电热套上加热至沸腾，加入淀粉液，至沸取出，冷却。

1.2.2 银杏叶中多糖的提取

1.2.2.1 不同提取方法提取多糖

将200 g银杏叶洗净、晒干、粉粹、50 ℃干燥备用。

酶法：称取银杏叶粉10 g，放置于250 mL烧瓶中，加蒸馏水150 mL，50 ℃恒温振荡2 h，加入纤维素酶0.05 g，用醋酸-醋酸钠缓冲溶液调节pH≈4.5，50 ℃水浴酶解50 min,抽滤，药渣加入50 mL蒸馏水，水浴提取2.5 h,抽滤，合并提取液[3-4]。

水提法：称取银杏叶粉10 g，放置于250 mL烧瓶中，加蒸馏水150 mL，50 ℃恒温振荡2 h，继续在50 ℃水浴提取50 min，抽滤，药渣加入50 mL蒸馏水，水浴提取2.5 h，抽滤，合并提取液。

1.2.2.2 除脂溶性杂质[5]

银杏叶提取液中加入10 mL乙醚，振荡10 min，置于分液漏斗中静置分液，收集下层的多糖溶液。

1.2.2.3 除蛋白质[6]

使用Sevag法，将脱脂后的银杏叶提取液与Sevag试剂以体积比3∶1 混合，充分振荡20 min，置于分液漏斗中静置分液，取上层溶液，得银杏叶多糖提取液。

1.2.2.4 乙醇沉淀多糖[7]

在装有多糖溶液的烧杯中加入3倍体积的质量分数95%乙醇，静置12 h；将沉淀后的多糖进行干燥，获得银杏叶多糖粗品。

2 结果与讨论

2.1 多糖粗品提取量比较

平行操作三次，比较提取量，结果见表1。

表1 不同方法提取银杏叶多糖提取量比较 g

由表1可知，酶解法的平均提取量高于传统的水解法。

2.2 银杏叶w(多糖粗品)的测定

2.2.1 葡萄糖标准曲线的绘制

移取0.00、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00 mL葡萄糖标准溶液于10 mL容量瓶中，分别加蒸馏水至2 mL，再加入蒽酮-浓硫酸试剂8 mL充分混匀，于100 ℃恒温水浴锅中保温10 min，室温冷却，在620 nm波长下测吸光度，以吸光度A对葡萄糖质量浓度ρ绘制标准曲线，进行线性回归，得标准曲线方程见图1。

ρ/(mg·mL-1)图1 葡萄糖标准曲线

2.2.2w(多糖)测定[8]

取银杏叶多糖粗品约15 mg，精密称定，于50 mL容量瓶中，用蒸馏水溶解并定容至刻度。将溶液过滤，弃去初滤液，取续滤液1.5 mL，加入水0.5 mL，再加入蒽酮-浓硫酸试剂8 mL充分混匀，于100 ℃ 恒温水浴锅中保温10 min，室温冷却，用紫外可见分光光度计在620 nm波长下测吸光度，平行三次，计算平均w(多糖)，结果见表2。

表2 银杏叶w(多糖)

由表2可知，银杏叶粗提物中平均w(多糖)为3.33%。

2.3 酶解法提取的银杏叶多糖产品分析

2.3.1 理化性质

干燥后的银杏叶多糖为灰白色粉末，水溶性较好，难溶于乙醇等有机试剂。

2.3.2 淀粉的碘反应[9]

将多糖配制成质量分数5%的溶液，取多糖指示液上清液和质量分数5%的多糖溶液各5 mL，加入碘-碘化钾0.2 mL，水浴加热5 min，观察颜色变化。银杏叶多糖溶液的碘-碘化钾反应呈阴性，表明银杏叶多糖不含淀粉。

2.3.3 银杏叶多糖红外光谱分析

将多糖与溴化钾烘干，取多糖2 mg与100 mg的溴化钾研磨，压片，在400～4 000 cm-1用红外光谱仪器进行扫描，红外色谱图见图2。

σ/ cm-1图2 银杏叶多糖红外吸收光谱

3 结 论

[1] 陈群,刘天骄.银杏叶多糖的抗肿瘤和免疫调节作用[J].中药药理与临床,2003(5):18-19.

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