不同品系猴头菇子实体中总酚含量测定

李洋洋，韩迪，闫宝松，郑健，*，阎秀峰

（1.东北林业大学盐碱地生物资源与环境研究中心/东北油田盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨150040；2.黑龙江省林副特产研究所黑龙江省非木质林产品研发重点实验室，黑龙江牡丹江157011）

不同品系猴头菇子实体中总酚含量测定

李洋洋1，韩迪1，闫宝松2，郑健1，*，阎秀峰1

（1.东北林业大学盐碱地生物资源与环境研究中心/东北油田盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨150040；2.黑龙江省林副特产研究所黑龙江省非木质林产品研发重点实验室，黑龙江牡丹江157011）

该文以猴头菇子实体为原料，采用超声波辅助提取法优化猴头菇总酚提取工艺条件。采用Folin-Ciocalteu比色法测定总酚的含量，没食子酸为标准品，以猴头菇子实体中总酚的含量为评价指标，分别对提取溶剂、提取时间和料液比进行优化，建立了猴头菇子实体中总酚的含量测定方法，得到最佳料液比1∶40（g/mL），纯水提取，提取时间60min，总酚含量在0～14μg时与吸光度呈良好的线性关系，其回归方程Y=0.037 3X+0.003 7，r≥0.999，平均加样回收率为101.41%，RSD为1.20%。同时，将该方法在最适条件下测定了10个不同品系猴头菇子实体中总酚的含量，不同品系猴头菇子实体中总酚的含量在2.20mg/g～4.77mg/g之间。结果表明，该方法简单、快速、重复性好，可用于猴头菇子实体的总酚含量测定方法。

猴头菇；Folin-Ciocalteu比色法；总酚；不同品系

酚类物质是主要存在于植物中的复杂酚类化合物，属植物的次生代谢产物[7-8]。目前食用菌酚类物质也有诸多报道，具有强大的抗氧化活性和清除自由基的能力，可作为天然的抗氧化剂。研究发现，一些食用菌的抗氧化活性与总酚的含量相关，酚类物质能够抑制动脉硬化、癌症等疾病，主要原因是酚类物质可以与金属离子螯合，减少金属离子对氧化反应的催化，抑制脂氧合酶，清除自由基[9]。本试验以酚类物质为测定目标，建立猴头菇子实体总酚含量的测定方法；同时对不同品系猴头菇子实体中总酚含量进行了测定，为猴头菇的质量控制和营养成分分析提供稳定、可靠的评价手段，并为人工栽培技术及在医药和食品行业的开发、应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

10个不同品系的猴头菇菌种分别采自黑龙江省林副特产研究所、海林、磨刀石、小兴安岭、大兴安岭、长白山、柴河、三道关、福建三明、浙江常山县（菌株名称分别为TC_1#、TC_2#、TC_3#、XXAL-Y、1001、CBSY、CH-Y、SDG-Y、Ha、99），之后在黑龙江省海林土砬子村的菇棚地进行繁殖培育，待成熟后于60℃烘干至恒重。

没食子酸标准品（纯度≥98%）：购自Sigma-Aldrich公司；甲醇、乙醇、丙酮：均为分析纯，购自天津市富宇精细化工有限公司；无水碳酸钠（分析纯），购自天津市致远化学试剂有限公司；Folin-Ciocalteu试剂（FC试剂），购自天津市光复精细化工研究所。

BIOMATE 3S型紫外-可见分光光度计：Thermo Scientific；CU-420型水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；LEGEND MICROITR型离心机：Thermo Scientific。

1.2 方法

1.2.1 对照品溶液的制备

精密称取一水合·没食子酸15.1mg，置锡箔纸包裹的2mL离心管中，加1.365mL纯水溶解，摇匀得质量浓度为10mg/mL的没食子酸母液，再用纯水稀释得质量浓度为0.1mg/mL的没食子酸对照品溶液。

1.2.2 标准曲线的绘制[10]

精密吸取对照品溶液0、20、30、40、60、80、100、120、140μL于离心管中，对应加入500、480、470、460、440、420、400、380、360μL纯水后，分别加入0.5mLFC试剂，混匀，避光反应2min，然后分别加入2mL 7.5% Na2CO3，最后加入1mL纯水摇匀，置于40℃水浴锅中暗水浴30min，用紫外可见分光光度计测定760 nm的吸光值。分别以没食子酸含量（X）为横坐标，吸光度（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得线性回归方程。

1.2.3 供试品溶液的制备

将干燥的猴头菇子实体粉碎，过60目筛。精密称取0.25 g样品（n=3），加8mL水超声60min，用水定容至10mL。取1.5mL溶液于2mL离心管中，12000 r/min离心10min，上清液转移至新的离心管中，即得猴头菇供试品溶液。

为优化提取工艺，选择不同提取溶剂（不同浓度乙醇溶液、25%甲醇、25%丙酮和纯水）、不同提取时间（15、30、45、60min）和不同料液比[1∶10、1∶20、1∶40、1∶100（g/mL）]进行提取工艺的优化。

1.2.4 猴头菇样品总酚含量的测定

精密吸取样品溶液0.1mL，加入0.4mL纯水后，再加入0.5mLFC试剂，混匀，避光反应2min，然后加入2mL 7.5%Na2CO3，最后加入1mL纯水摇匀，置于40℃水浴锅中暗水浴30min，用紫外可见分光光度计测定760 nm的吸光值。根据标准曲线计算总酚浓度。

1.2.5 Folin-Ciocalteu比色法方法学评价

1）稳定性：取同一样品溶液0.1mL，按显色条件显色完全后测吸光值，分别在0、15、30、60、90、120min测吸光值。

2）精密度：取0.1mL待测溶液1份，按显色条件显色完全后测吸光值，连续测6次。

3）重复性：取0.1mL待测溶液6份，按显色条件显色完全后测吸光值。

4）加样回收率：按照最佳提取工艺，制备猴头菇供试品溶液。精密吸取0.1mL猴头菇试样，按显色条件反应，在760 nm条件下测吸光值。根据标准曲线方程计算样品中总酚的含量，测定猴头菇溶液中总酚含量；取0.05mL猴头菇试样，分别加入0.05mL浓度依次为30、80、140μg/mL的没食子酸对照品溶液，根据标准曲线方程计算该样品中总酚的含量，计算回收率。

1.2.6 数据分析

检测数据以平均数±标准偏差表示，采用SPSS17.0 Duncan法进行显著性分析，运用Microsoft Excel软件绘制图表。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

根据1.2.2项的方法，分别以没食子酸含量（X）为横坐标，吸光度（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得线性回归方程为：Y=0.037 3X+0.003 7，r=0.999 6。结果表明总酚含量在0～14μg范围内线性关系良好。标准曲线见图1。

2.2 总酚提取单因素试验

2.2.1 提取溶剂对猴头菇总酚含量的影响

首先选择料液比1∶40（g/mL），提取时间60min，分别在体积分数为25%、50%、75%和100%的甲醇中超声辅助提取，考察不同浓度甲醇对于猴头菇总酚提取效率的影响。试验结果表明，在25%的甲醇中提取效率最高，50%次之，100%甲醇提取效率最低，说明有机相越少，猴头菇总酚的提取效率越高。

其次分别选用25%甲醇、25%乙醇、25%丙酮和纯水进行超声辅助提取，结果如图2A所示。由图2A可知，水提猴头菇总酚含量最高，为3.17mg/g±0.12mg/g，显著高于其他溶剂的提取含量，主要原因是酚类物质含有羟基，是极性大分子化合物，提取溶剂的极性越大，溶解度越大，得到总酚含量越高。故选择水作为总酚提取的溶剂。

2.2.2 提取时间对猴头菇总酚含量的影响

选择料液比1∶40（g/mL），最佳提取溶剂（水），选取提取不同时间（15、30、45、60min）进行超声辅助提取，研究不同提取时间对猴头菇总酚含量的影响，结果如图2B所示。由图2B可知，提取时间越长，总酚提取含量越高，提取时间为60min时，总酚含量达到3.32mg/g。但相邻两个时间点的猴头菇总酚提取效率没有显著性差异，结合实际情况，选择提取时间为60min。

2.2.3 料液比对猴头菇总酚含量的影响

选择最佳提取溶剂（水）和提取时间（60min），样品分别以料液比1∶10、1∶20、1∶40、1∶100（g/mL）的比例进行超声辅助提取，研究不同料液比对猴头菇总酚含量的影响，结果如图2C所示。由图2C可知，随着料液比的增加，总酚含量随之增加。主要原因是溶剂的量越多，传质动力越大，扩散到溶剂里的酚类物质就越多。考虑到提取溶剂用量过多，对后面的试验步骤带来不便，因此选择1∶40（g/mL）作为总酚含量提取的最佳料液比。

图2 提取溶剂（A），提取时间（B）和料液比（C）对猴头菇中总酚含量的影响Fig.2 Effect of extraction solvent（A），extraction time（B）and solid to liquid ratio（C）on total polyphenols content from Hericium erinaceus

2.3 Folin-Ciocalteu比色法评价

按照本研究确定的最佳提取工艺，根据1.2.5项的方法，对本研究所采用的Folin-Ciocalteu比色法的稳定性、精密度、重复性和加样回收率进行评价，结果分别见表1和表2。

由表1和表2表明，在本实验室条件下，该比色显色方法灵敏度较高、准确可靠，可重复性较好，比较稳定，适用于对猴头菇样品进行总酚的定量测定。

2.4 不同品系猴头菇子实体样品中的总酚含量

在上述Folin-Ciocalteu比色法方法学考察的基础上，按照最佳提取工艺对不同品系猴头菇子实体样品中的总酚含量进行测定，结果如图3所示。

表1 Folin-Ciocalteu比色法的稳定性、精密度、重复性试验结果Table1 Results of stability，precision and repeatability experiment of Folin-Ciocalteu colorimetry

表2 Folin-Ciocalteu比色法的回收率试验结果Table2 Results of recovery rate experiment of Folin-Ciocalteu colorimetry

图3 不同品系猴头菇总酚含量Fig.3 Total polyphenols contents in different Hericium erinaceu strains

由图3可知，10个不同品系猴头菇中总酚含量在2.20mg/g～4.77mg/g，不同猴头菇品系中总酚含量存在显著差异。其中，采自浙江常山县（99）的猴头菇菌株培育的猴头菇中总酚含量最高，其次为采自柴河（CHY）、林副特产所（TC_1#）、长白山（CBS-Y）、山道关（SDG-Y）和海林（TC_2#）的猴头菇菌种培育的猴头菇，采自福建三明（Ha）和磨刀石地区的猴头菇菌种培育的猴头菇中总酚含量最低。

3 结论

酚类物质是蘑菇子实体中主要活性成分之一，它在生物抗氧化防御体系中具有重要作用[11]。蘑菇总酚含量影响其抗氧化能力的大小，因此，该方法可以作为猴头菇质量评价研究的方法之一，为人工栽培与选育猴头菇品种提供参考。

通过单因素试验考察了提取溶剂（25%甲醇、25%乙醇、25%丙酮、纯水）、提取时间（15、30、45、60min）、料液比[1∶10、1∶20、1∶40、1∶100（g/mL）]对猴头菇总酚提取的影响，最终优选出的提取条件为纯水提取，提取时间60min，料液比1∶40（g/mL）。该方法简单、稳定性好、精密度高。本试验通过对10个不同品系猴头菇子实体总酚含量的测定，采用SPSS 17.0 Duncan法进行显著性分析，结果表明：不同品系猴头菇中总酚含量差异显著，其中99号总酚含量明显高于其他品种，其含量为4.77mg/g。

[1]王薇.猴头菇的营养保健功能及其在食品工业中的应用[J].食品与药品,2006,8(4):24-26

[2]王晓玉,蒋秋燕,凌沛学,等.猴头菌活性成分及药理作用研究进展[J].中国生化药物杂志,2010,31(1):70-72

[3]Khan M A,Tania M,Liu R,et al.Hericium erinaceus:an edible mushroom with medicinalvalues[J].Journalofcomplementary&integrativemedicine,2013,10(1):253-258

[4]张沿江,吴金玉,孙艳辉,等.猴头菇的药用功能及其菌丝粉冲剂的制作[J].食药用菌,2014,22(1):41-42

[5]黄巧珍,黄巧平,刘正德,等.猴头菇高产栽培技术[J].中国园艺文摘,2015(3):170-178

[6]宋海艳.猴头菇栽培技术要点[J].中国农业信息,2014(23):36

[7]陈晓英.蘑菇酚类物质的提取及其抗氧化活性的研究[D].福州:福建农林大学,2011

[8]Balasundram N,Sundram K,Samman S.Phenolic compounds in plants and agriindustrial by-products:antioxidant activity,occurrence,and potential uses[J].Food Chemistry,2006,99(1):191-203

[9]Li H,Park S,Moon B,et al.Targeted phenolic analysis in Hericium erinaceum and its antioxidant activities[J].Food Sci Biotechnol,2012, 21(3):881-888

[10]颜小捷,谷陟欣,卢凤来,等.FOLIN-酚比色法测定裸花紫珠中总酚含量[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(18):74-78

[11]王丽芳.双孢蘑菇抗氧化活性及品质控制研究[D].北京:中国农业科学院,2015

Determination of Total Polyphenol Content from Different Hericium erinaceus Strains

LI Yang-yang1，HAN Di1，YAN Bao-song2，ZHENG Jian1，*，YAN Xiu-feng1
（1.Alkali Soil Natural Environmental Science Center，Northeast Forestry University/Key Laboratory of Salinealkali Vegetation Ecology Restoration in Oil Field，Ministry of Education，Harbin 150040，Heilongjiang，China；2.Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Non-wood Forest Product Development，Heilongjiang Forest Byproduct and Speciality Institute，Mudanjiang 157011，Heilongjiang，China）

The total polyphenol content from Hericium erinaceus was abstracted by ultrasonic-assisted extraction. The total polyphenol content was analyzed by Folin-Ciocalteu（FC）colorimetry method，and gallic acid was used as reference substance. Effects of extraction solvent，extraction time and solid to liquid ratio on total polyphenols content from Hericium erinaceus were investigated. It showed that the optimized extraction conditions were water extract，the extraction time was 60 min and the solid-liquid ratio is 1 ∶ 40（g/mL）. The calibration curves were linear over gallic acid content ranging from 0～14 μg，the typical standard curves were Y =0.037 3X+0.003 7 with the line regression correlation coefficients greater than 0.999. The average recovery was 101.41 % with RSD of 1.20 %. This method was also successfully applied to the determination of total polyphenols content from ten different Hericium erinaceus strains. The total polyphenol content from different Hericium erinaceus strains between 2.20 mg/g～4.77 mg/g .This method established is simple，rapid and repeatable，which is suitable for analysis of total polyphenols in Hericium erinaceus.

Hericium erinaceus；Folin-Ciocalteu（FC）colorimetry method；total phenols；different strains

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.04.026

林业公益性行业科研专项经费（201404703）

李洋洋（1991—），女（汉），硕士研究生，主要从事细胞活性产物研究。

2016-05-30

猴头菇（Hericium erinaceus）属齿菌科真菌猴头菌，又名狮鬃菇或刺猬菌，是一种珍贵的药食兼用菌。

*通信作者猴头菇营养丰富，味道鲜美，素有“山珍猴头，海味燕窝”之说。猴头菇的药效成分主要有多糖、低聚糖、多酚、猴头菌素、猴头菌酮、甾醇类和脂肪酸等，具有保肝护胃、抗癌、抗氧化、保护神经、调节免疫和防治心血管疾病等作用[1-3]，能够治疗胃炎，修复消化道粘膜，对食道癌、胃癌等肿瘤有很好的抑制作用，对眩晕、失眠、阳痿、体质虚弱、心脑血管患者有较好的调理作用[4]。野生猴头菇主要生长在东北大兴安岭，常于春夏之交生于麻栎、板栗等活立木的死结、树洞及朽木上。目前野生猴头菇较为稀少，人工种植技术始于20世纪50年代末，猴头菇营养价值高可作为保健品，药用价值也高度受到人们的喜爱，所以猴头菇品种的优选对于人工种植优质猴头菇具有重要意义[5-6]。