肺炎克雷伯杆菌对碳青霉烯类的耐药机制

刘景双 刘向群

肺炎克雷伯杆菌对碳青霉烯类的耐药机制

刘景双1刘向群2

肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae ，KP)为一种无自主能动能力、有荚膜、兼性厌氧、乳糖发酵的革兰阴性条件致病菌[1]，常常存在于人类的口腔、皮肤、肠道、尿道等部位[2]，可引起肺炎、尿路感染、脑脊膜炎、败血症、菌血症、腹泻等相关感染性疾病[3]。在抗生素不断选择、抗感染治疗的时间延长及抗生素选择的剂量及手术操作等多方面因素影响下，多重耐药肺炎克雷伯杆菌逐渐增多[4]，特别是耐碳青霉烯类肺炎克雷伯杆菌(carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP) 的增多，给临床医生带来的极大的挑战。本文主要对CRKP的耐药机制进行总结，以对临床医生抗生素的合理使用、促进疾病的愈合及减少耐药菌株的扩散提供帮助。

CRKP的耐药机制主要有以下几个方面：产ESBLs、减少外膜的通透性、增加外排泵的外排作用[5]等。

ESBLs

ESBLs为β-内酰胺酶的集合，可水解青霉素、头孢菌素、单菌胺类等抗生素[6]。ESBLs的产生具有地域特性，并且与高发病率及高死亡率相关。最初的ESBLs的定义是根据其水解能力，之后发展为目前Amber分类的A、B、C、D类[7]。A类以丝氨酸残基为活性位点，包括KPC、CTX--M、SHV1、TEM1、ROB1等；B类为金属酶，以金属离子为活性位点，目前最受关注的为新德里β-内酰胺酶(NDM)；C类为头孢菌素酶(Ampc)，同样以丝氨酸残基为活性位点；D类为青霉素酶(OXA)。原酶活性位点的突变会使其可水解的底物扩增，这些酶在抗生素选择的压力下通过质粒向外传播，扩大其耐药的范围[7]。其中与CRKP相关的ESBLs主要为A类中的KPC酶、B类中的NDM及D类中的OXA[8]，他们可不被β-内酰胺酶抑制剂抑制，并可产生碳青霉烯酶活性。

一、产KPC酶

产KPC酶为KP对碳青霉烯类耐药的最为常见的机制，在2001年，产KPC酶的KP菌株在卡莱罗纳的北部被发现[5]，KPC酶分为KPC1-19共19种，其中最为常见的为KPC-2和KPC-3[9]，KPC酶为A类β-内酰胺酶，在KP、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、变形杆菌、柠檬酸杆菌及沙门菌中均有发现。编码KPC的基因由质粒介导，且其侧面由可移动的基因片段填充，这就使得其可由质粒转移至染色体，同样可由染色体转移至质粒[10]。国外的相关报道KPC编码基因位于Tn4401的Tn3型转座子上，这类转座子可使基因插入不同的G-性细菌的不同质粒，这与KPC酶的迅速扩散相关[3，11]。在国内的原始研究中显示与国外不同，KPC-2基因位于Tn1721的Tn3型转座子上，到目前为止尚未发现携带KPC基因的Tn4401菌株[12-15]。KPC酶可使细菌对所有的β内酰胺类抗生素均可耐药，包括：青霉素类、头孢类、单菌胺类及碳青霉烯类[16]，给临床药物的选择带来极大的困扰。因此有效的KPC检测方法尚需进一步去探索，提高对KPC检测的敏感性，减少KPC基因的扩散，可有效减少多重耐药菌株的出现。

二、新德里β-内酰胺酶(NDM-1)

NDM-1为一种新的具有碳青霉烯酶活性的金属β-内酰胺酶，2008年在KP中首次被发现[15]。NDM-1最先在KP及大肠杆菌中发现，blaNDM-1由质粒编码，并可转化结合到其他菌株，这可帮助其迅速在不同的菌种间播散，且blaNDM-1基因往往与其他耐药决定因子相结合，这可大大增加其耐药能力。在一些菌株中基因区域可以形成连续重复的复制，从而提高其复制的数量，促进其基因的扩散[17]。blaNDM-1基因在不同的质粒中被发现，包括IncA/C、IncF、IncL/M等，IncN质粒在临床上同时编码其他重要的耐药基因，包括blaCTX-M、blaIMP、blaNDM、blaKPC[18]，这是各种酶类协同发挥耐药作用的基因基础，携带耐药基因的质粒在不同细菌间传播，造成耐药的流行，NDM目前发现同样与多种亚型，如NDM-3及NDM-5等，但目前尚缺乏对其有效的检测方法，尚需我们进一步去探索。

三、OXA

OXA为一类具有碳青霉烯酶活性的苯唑西林酶，临床上发现的OXA变种越来越多，并具有广谱的水解活性。在CRKP中发现的有OXA-181、OXA-48、OXA-244、OXA-1等。有研究发现ISEcp1-OXA-181转座子的3个复制片段在染色体从始至终均存在，其中一个片段可导致mgrB基因的失活(mgrB基因为phoPQ的负调控者)，而mgrB基因的失活会导致多粘菌素耐药[19]。ISEcp1插入片段在blaCTX-M、blaCYM、blaACC中同样有发现，这与blaOXA-181中的插入序列相似[20]，均可提高厄他培南、亚胺培南、美罗培南的MICs，产生耐药性。2003年OXA-48首先在土耳其的临床KP菌株中报道[21]，目前为止已在多种菌株中被发现。blaOXA-48基因广泛扩散在肠杆菌科中定位在64kb的结合质粒上，属于IncL/M中的一员。这种质粒的特点是具有高转移率及广阔的宿主。他们的高共轭性可能是由于失活的TIR基因编码接合性质粒转移抑制因子，通过插入复合转座子Tn1991 / Tn1991、2 携带blaOXA-48-like基因[22],基因一旦形成，便可在不同的宿主间传播，并可在抗生素不断选择的压力下产生突变，从而产生不同的亚型。有研究显示一些OXA的变种是由于其blaOXA-48基因编码的一些氨基酸替换而导致酶的不同[23]。例如在西班牙发现的OXA-244与OXA-48的不同之处在于一个核苷酸的替换A640G，这就导致了一个氨基酸的替换Arg214Gly[23]。OXA-1在G-杆菌的质粒及整合体中被发现，且其与CTX-M-15结合可对β-内酰胺类与酶抑制剂的复合物产生耐药[24]。

四、其他ESBLs

除了上述三种ESBLs外，在KP中尚有其他的ESBLs参与碳青霉烯类的耐药，如CTX-M、TEM、SHV等[5]。CTX-M尤其在KP及大肠埃希菌中流行，多种遗传机制为其提供了异型多样性，也是其基因决定簇快速传播的基础。CTX-M型往往在院外播散，而在院内则由TEM、SHV所取代[7]，而他们各亚型之间往往仅有点突变的不同。如SHV-31与SHV-1氨基酸序列的不同是由两个点突变造成的，分别为L35Q和E240K，SHV-31与SHV-12仅有一个点突变的不同。

外膜孔蛋白的突变

多个研究[6，19，24-25]中显示在CRKP中均有外膜孔蛋白的突变，从而降低外膜对抗生素的渗透性。染色体编码的外膜孔蛋白基因的突变备受关注，其中研究较为清楚的为Ompk35、Ompk36。Ompk36发生较大变化，其氨基酸序列的改变位于L3环上，L3环组成了孔蛋白的通道小孔，L3的改变与碳青霉烯类耐药相关。另外，Ompk35插入IS序列导致Ompk35的失活[19]。有研究显示OmpK35发生框移突变，这些突变包括一个碱基对的插入或是一个碱基对的删除，亦或是一个氨基酸的替换，这导致基因区间的提前出现终止密码子，从而使转录的肽链提前结束。Ompk36的突变修饰更是多变的，在Ompk36中插入的包含插入序列(IS)的两条链破坏了开放阅读框架区域，使终止密码子提前出现，而使肽链的转录提前结束[26]。这与Sugumar M等的研究结果相似[24]。两种孔蛋白各自对碳青霉烯耐药的影响尚不明确，在KP中两种孔道蛋白对产生碳青霉烯类耐药均有作用[27]，单纯Ompk35的丢失对耐药影响较小，而Ompk36的丢失可以显著增加产ESBL及AmpC细菌的青霉素及碳青霉烯类的MIC，两者同时丢失则产生对大多数青霉素及碳青霉烯类的耐药[23]。

外排泵的改变

增加外排泵对抗生素的外排作用是细菌对多数抗生素的共同耐药机制，在KP中参与临床相关抗药性的外排泵大部分属于抗药小结分裂区(RND)家族，RND位于内膜区，并且有广泛的底物范围，外排泵的内膜结合蛋白决定了底物的特异性及广泛性，可外排不同结构的抗菌药物。当外排泵底物的抗生素作用于菌株时，可使外排泵基因表达增加，从而形成对此抗生素的耐药。碳青霉烯类抗生素的使用不仅可造成细菌对其耐药，同样可造成细菌对其他药物耐药，如替吉环素、米诺环素等。在对CRKP的研究中发现，外排泵基因acrA、acrB、tolC、oqxA、oqxB表达增加，及外排泵调节因子acrR、marA、soxS、rarA、ramA表达增加。其中AcrAB-TolC系统及OqxAB系统发挥重要作用[28]，AcrAB有广泛的底物范围，包括喹诺酮类、氯霉素、大环内酯类、β内酰胺类等，他们与Tolc相结合可增强其外排作用[29]。有研究显示[30-32]，AcrAB-TolC系统的表达增加，与acrR的突变有关，acrR为AcrAB的抑制性调节因子，acrR的突变导致其失活，从而使其对外排泵的抑制作用减弱而使其表达增加。值得庆幸的是由外排泵表达增加所致的细菌耐药可由外排泵抑制剂所逆转[33]，这为我们临床研究相关药物提供契机。

总 结

值得注意的是单一的β-内酰胺酶对碳青霉烯类的抵抗作用是非常微弱的，他们需与其他的酶类或其他耐药机制联合作用，如产KPC酶与膜蛋白的突变相结合或外膜孔蛋白的突变与外排泵外排增加相结合，各种机制相互作用从而形成菌株对多种抗生素的耐药，使我们在有限的抗生素面前面临着巨大的选择压力，了解细菌耐药机制的变化情况，根据细菌耐药机制的变化选择针对性药物及为研制新药提供方向，是我们接下来努力的方向。另外新的耐药机制的产生往往是在抗生素选择压力下细菌为生存所做出的改变，临床合理选择抗生素将有效减少细菌突变及减少超级耐药菌的产生，这就要求我们除有丰富的临床经验外，较为敏感的耐药菌检测方法也是迫切需要的，目前各种实验方法还处在探索阶段，为限制多重耐药菌的扩散，指导临床合理应用抗生素，在新生抗生素研发出来前，对细菌耐药机制更为敏感的实验室检测方法是非常有必要的，这也值得我们去更加深入的探索。

[1] Parasion S,Kwiatek M,Gryko R,et al.Bacteriophages as an alternative strategy for fighting biofilm development[J].Pol J Microbiol,2014,63(2):137-145.

[2] Zhou XY,Ye XG,He LT,et al.In vitro characterization and inhibition of the interaction between ciprofloxacin and berberine against multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae[J].J Antibiot (Tokyo), 2016,69(10):741-746.

[3] Bina M,Pournajaf A,Mirkalantari S,et al.Detection of the Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) in K. pneumoniae Isolated from the Clinical Samples by the Phenotypic and Genotypic Methods[J].Iran J Pathol,2015,10(3):199-205.

[4] Hidron AI,Edwards JR,Patel J,et al.Antimicrobial-resistant pathogens associated with healthcare-associated infections: Annual Summary of Data Reported to the National Healthcare Safety Network at the Centres for Disease Control and Prevention, 2006-2007[J].Infect Control Hosp Epidemiol,2008,29(11):996-1011.

[5] Shanmugam P,Meenakshisundaram J,Jayaraman P.blaKPC gene Detection in Clinical Isolates of Carbapenem Resistant Enterobacteriaceae in a Tertiary Care Hospital[J].J Clin Diagn Res,2013,7(12):2736-2738.

[6] Ng TM,Khong WX,Harris PN,et al.Empiric Piperacillin-Tazobactam versus Carbapenems in the Treatment of Bacteraemia Due to Extended-Spectrum Beta-Lactamase-Producing Enterobacteriaceae[J].PLoS One,2016, 11(4):e0153696.

[7] Curello J,MacDougall C.Beyond Susceptible and Resistant,Part II: Treatment of Infections Due to Gram-Negative Organisms Producing Extended-Spectrum β-Lactamases[J].J Pediatr Pharmacol Ther,2014, 19(3):156-164.

[8] Fursova NK,Astashkin EI,Knyazeva AI,et al.The spread of bla OXA-48 and bla OXA-244 carbapenemase genes among Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis and Enterobacter spp. isolated in Moscow, Russia[J].Ann Clin Microbiol Antimicrob,2015,14:46.

[9] 刘琳,叶贤伟,张湘燕.耐碳青霉烯类肺炎克雷伯杆菌耐药机制与检测[J].临床内科杂志，2015，32(6)：428-430.

[10] Raghunathan A,Samuel L,Tibbetts RJ.Evaluation of a Real-Time PCR Assay for the Detection of the Klebsiella pneumoniae Carbapenemase Genes in Microbiological Samples in Comparison With the Modified Hodge Test[J].Am J Clin Pathol,2011,135(4):566-571.

[11] Anderson KF,Lonsway DR,Rasheed JK,et al.Evaluation of Methods To Identify the Klebsiella pneumoniae Carbapenemase in Enterobacteriaceae[J].J Clin Microbiol,2007,45(8):2723-2725.

[12] Yong D,Toleman MA,Giske CG,et al.Characterization of a new metallo-beta-lactamase gene, blaNDM-1, and a novel erythromycin esterase gene carried on a unique genetic structure in Klebsiella pneumoniae sequence type 14 from India[J].Antimicrob Agents Chemother,2009, 53(12):5046-5054.

[13] Jiang Y,Yu D,Wei Z,et al.Complete nucleotide sequence of Klebsiella pneumoniae multidrug resistance plasmid pKP048, carrying blaKPC-2, blaDHA-1, qnrB4, and armA[J].Antimicrob Agents Chemother,2010,54(9):3967-3969.

[14] Liu P,Li P,Jiang X,et al.Complete genome sequence of Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae HS11286, a multidrug-resistant strain isolated from human sputum[J].J Bacteriol,2012,194(7):1841-1842.

[15] Chen YT,Lin JC,Fung CP,et al.KPC-2-encoding plasmids from Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in Taiwan[J].J Antimicrob Chemother,2014,69(3):628-631.

[16] Hirsch EB,Tam VH.Detection and treatment options for Klebsiella pneumonia carbapenemases (KPCs): an emerging cause of multidrug-resistant infection[J].J Antimicrob Chemother,2010,65(6):1119-1125.

[17] Hudson CM,Bent ZW,Meagher RJ,et al.Resistance determinants and mobile genetic elements of an NDM-1-encoding Klebsiella pneumoniae strain[J].PLoS One,2014,9(6):e99209.

[18] Chen CJ,Wu TL,Lu PL,et al.Closely related NDM-1-encoding plasmids from Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in Taiwan[J].PLoS One,2014,9(8):e104899.

[19] Zowawi HM,Forde BM,Alfaresi M,et al.Stepwise evolution of pandrug-resistance in Klebsiella pneumoniae[J].Sci Rep,2015,5:15082.

[20] Potron A,Nordmann P,Lafeuille E,et al.Characterization of OXA-181, a carbapenem-hydrolyzing class D beta-lactamase from Klebsiella pneumoniae[J].Antimicrob Agents Chemother,2011,55(10):4896-4899.

[21] Magiorakos AP,Srinivasan A,Carey RB,et al.Multidrug-resistant, extensively drug-resistant and pandrug-resistant bacteria: an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance[J].Clin Microbiol Infect,2012,18(3):268-281.

[22] Potron A,Poirel L,Nordmann P.Derepressed transfer properties leading to the efficient spread of the plasmid encoding carbapenemase OXA-48[J].Antimicrob Agents Chemother,2014,58(1):467-471.

[23] Martínez-Martínez L,González-López JJ.Carbapenemases in Enterobacteriaceae: types and molecular epidemiology[J].Enferm Infecc Microbiol Clin,2014,32 Suppl 4:4-9.

[24] Sugumar M,Kumar KM,Manoharan A,et al.Detection of OXA-1 β-lactamase gene of Klebsiella pneumoniae from blood stream infections (BSI) by conventional PCR and in-silico analysis to understand the mechanism of OXA mediated resistance[J].PLoS One,2014,9(3):e91800.

[25] Tang HJ,Ku YH,Lee MF,et al.In Vitro Activity of Imipenem and Colistin against a Carbapenem-Resistant Klebsiella pneumoniae Isolate Coproducing SHV-31, CMY-2, and DHA-1[J].Biomed Res Int,2015,2015:568079.

[26] Stein C,Makarewicz O,Bohnert JA,et al.Three Dimensional Checkerboard Synergy Analysis of Colistin, Meropenem, Tigecycline against Multidrug-Resistant Clinical Klebsiella pneumonia Isolates[J].PLoS One,2015,10(6):e0126479.

[27] Martinez-Martinez L.Extended-spectrum beta-lactamases and the permeability barrier[J].Clin Microbiol Infect,2008,14 Suppl 1:82-89.

[28] Zhong X,Xu H,Chen D,et al.First emergence of acrAB and oqxAB mediated tigecycline resistance in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae pre-dating the use of tigecycline in a Chinese hospital[J].PLoS One,2014,9(12):e115185.

[29] Padilla E,Llobet E,Doménech-Sánchez A,et al.Klebsiella pneumoniae AcrAB efflux pump contributes to antimicrobial resistance and virulence[J].Antimicrob Agents Chemother,2010,54(1):177-183.

[31] Dean CR,Narayan S,Daigle DM,et al.Role of the AcrAB-TolC efflux pump in determining susceptibility of Haemophilus influenzae to the novel peptide deformylase inhibitor LBM415[J].Antimicrob Agents Chemother, 2005,49(8):3129-3135.

[31] Rodríguez-Martínez JM,de Alba PD,Briales A,et al.Contribution of OqxAB efflux pumps to quinolone resistance in extended-spectrum-β-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae[J].J Antimicrob Chemother,2013,68(1):68-73.

[32] Bialek-Davenet S,Marcon E,Leflon-Guibout V,et al.In vitro selection of ramR and soxR mutants overexpressing efflux systems by fluoroquinolones as well as cefoxitin in Klebsiella pneumoniae[J].Antimicrob Agents Chemother,2011,55(6):2795-2802.

[33] Hasdemir UO,Chevalier J,Nordmann P,et al.Detection and prevalence of active drug efflux mechanism in various multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae strains from Turkey[J].J Clin Microbiol,2004,42(6):2701-2706.

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.06.044

1. 221000 江苏 徐州，徐州医科大学 2. 221002 江苏 徐州，徐州市第一人民医院

刘向群，E-mail：hxlxq68@sina.com

2016-10-20]