超声辅助双水相体系提取水飞蓟中水飞蓟宾的工艺优选

阮洪生，贾桂燕，吴志军，郑小亮

（1.黑龙江八一农垦大学，大庆 163319；2.浙江医药高等专科学校）

超声辅助双水相体系提取水飞蓟中水飞蓟宾的工艺优选

阮洪生1，2，贾桂燕1，吴志军1，郑小亮1

（1.黑龙江八一农垦大学，大庆 163319；2.浙江医药高等专科学校）

为优化水飞蓟中水飞蓟宾的提取工艺，以乙醇体积分数、硫酸铵用量、料液比和超声时间为自变量，水飞蓟宾含量为因变量，采用星点设计-响应面法优选超声辅助双水相体系提取工艺参数。研究结果表明，最佳工艺条件为：乙醇体积分数为57%，硫酸铵的用量为0.26 g·mL-1，料液比为25 mL·g-1，超声时间为19 min，水飞蓟宾含量为10.18 mg·g-1。该工艺适用于水飞蓟中水飞蓟宾的提取，方法简单，预测性较好。

双水相；超声提取；水飞蓟；水飞蓟宾

水飞蓟为菊科植物水飞蓟Silybum marianum（L.）Gaertn.的干燥成熟果实，具有清热解毒，疏肝利胆的功效，用于治疗肝胆湿热、胁痛、黄疸[1]。水飞蓟中提取的水飞蓟素为黄酮木质素，其中水飞蓟宾含量最高，也是水飞蓟素中的主要活性成分[2-3]。研究报道水飞蓟宾具有抗氧化、抗癌、抗炎、抑菌、抗抑郁和降血脂等药理活性[4]。

水飞蓟素的提取方法有碱提酸沉法、有机溶剂提取法、热回流提取法、超声波提取法、微波辅助提取法、超临界CO2萃取法等[5]，各种提取方法利弊不同。超声提取法也是常用的提取物方法[6-8]。双水相提取技术已经广泛应用于中药活性成分分离，文献报道主要集中在黄酮、生物碱、萜类、多酚、色素和蒽醌等化合物[9]。目前尚无双水相体系提取水飞蓟中水飞蓟宾的研究报道。实验采用乙醇-硫酸铵双水相体系与超声法相结合，采用星点设计-响应面法优选水飞蓟中水飞蓟宾提取工艺，为工业化提取水飞蓟提供绿色环保工艺。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

水飞蓟购自安徽亳州中药饮片有限公司。水飞蓟宾对照品（上海紫一试剂厂，纯度≥98%，批号ZY141110）；甲醇（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；实验用水为娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Shimadzu LC2010HT高效液相色谱仪，FA2004N型电子天平，KQ-600E型超声波清洗器。

1.3 实验方法

1.3.1 双水相体系组成

一定浓度的乙醇溶液中加入定量的硫酸铵，利用硫酸铵的盐析作用形成双水相体系。试验通过改变成相后乙醇与水的比例以及硫酸铵的用量来控制双水相体系的形成[10]。

1.3.2 水飞蓟宾的超声提取与双水相分离

准确称取经过脱脂处理的1 g水飞蓟粉于100 mL具塞锥形瓶中，按照实验设定的料液比加入一定浓度的乙醇溶液和一定量的硫酸铵，搅拌溶解后，在确定的超声功率下超声一定时间，超声完毕后，过滤，滤液置于分液漏斗中静置分层，上层清液为水飞蓟乙醇提取液，提取液减压浓缩至干，色谱甲醇溶解并定容到10 mL容量瓶中，用于测定粗提物中水飞蓟宾含量。

1.3.3 水飞蓟宾含量测定的色谱条件

Kromasil C18色谱柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流动相甲醇-水-冰醋酸（48∶52∶1），流速1 mL·min-1，检测波长287 nm，柱温25℃，进样量10 μL。理论板数按水飞蓟宾峰计算不低于5 000[1]。

1.3.4 标准曲线的建立

取水飞蓟宾对照品适量，精密称定，置10 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含0.12 mg的溶液。精密吸取水飞蓟宾对照品溶液5，10，15，20，25 μL注入液相色谱仪中，按上述色谱条件测定峰面积。以对照品溶液进样量（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.5 星点试验设计[11]

在单因素试验的基础上，选取对水飞蓟宾含量具有显著影响的乙醇体积分数、硫酸铵用量、料液比和超声时间4个因素为自变量，每个自变量确定5个水平，分别用代码-α，-1，0，1，α（α=1.682）表示，共29个试验点（5个中心点）。试验设计见表1。

表1 提取工艺因素水平编码Table 1Factors and levels of response surface methodology test

2 结果与分析

2.1 回归方程

根据进样量及对应的峰面积，得到回归方程Y= 4 534 782.36X-782 563.2，r=0.999 9，表明水飞蓟宾在0.60～3.00 μg与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.2 模型的建立与方差分析

运用Design-Expert 7.0.0软件对表2中数据进行二次多元回归拟合，回归模型方差分析见表3，得到的自变量与因变量间的回归方程为：

表3中模型的F值为211.61，P＜0.000 1，表明该二次多元回归模型极显著。回归方程决定系数0.995 3，说明模型能解释99.53%响应值的变化，拟合情况良好。结果表明，一次项交互项及二次项对响应值的线性效应极显著（P＜0.000 1），交互项（对响应值的曲面效应作用显著（P＜0.05）。失拟项的P值为0.161 8，大于0.05，说明该模型拟合度好，试验误差小，所建立的模型是可行的。

表2 星点试验设计与结果Table 2Design and results of response surface methodology test

表3 回归模型方差分析Table 3Variance analysis results of regression model

续表3回归模型方差分析Continued table 3Variance analysis results of regression model

2.3 响应面分析

根据回归方程，在保持2个因素编码值为0时，运用Design-Expert 7.0.0软件绘制另2个因素与水飞蓟宾含量关系的三维响应面图（图1～6）。响应面为响应值对两两交互因素所构成的三维空间曲线图，效应面曲线越陡峭，说明各自变量对响应值的影响越明显。取回归模型最大值点，X的代码值分别为-0.38、-0.74、0.56、-0.76，对应的实测值乙醇体积分数为57%，硫酸铵的用量为0.26 g·mL-1，料液比为25 mL·g-1，超声时间为19 min，水飞蓟宾含量为10.18 mg·g-1。

图1 乙醇体积分数和硫酸铵用量对水飞蓟宾含量的响应面图Fig.1Response surface plots of the effect of ethanol concentration and consumption of ammonium sulphate on the silymarin yield

2.4 验证试验

按优选的工艺条件重复3次试验，得到的水飞蓟宾含量为10.18 mg·g-1（RSD 1.62%），与预测值10.16 mg·g-1相符，说明优选的工艺条件重现性好，建立的数学模型预测性好。在料液比均为25 mL·g-1的条件下，采用不同方法提取水飞蓟宾，结果见表4。结果超声辅助双水相体系法与连续回流法、微波提取法、超声提取法相比，具有省时、提取率高的优点。

图2 乙醇体积分数和料液比对水飞蓟中水飞蓟宾含量的响应面图Fig.2Response surface plots of the effect of ethanol concentration and sample/solvent ratio on the silymarin yield

图3 乙醇体积分数和超声时间对水飞蓟中水飞蓟宾含量的响应面图Fig.3Response surface plots of the effect of ethanol concentration and ultrasonic time on the silymarin yield

图4 硫酸铵用量和料液比对水飞蓟中水飞蓟宾含量的响应面图Fig.4Response surface plots of the effect of consumption of ammonium sulphate and sample/solvent ratio on the silymarin yield

图5 硫酸铵用量和超声时间对水飞蓟中水飞蓟宾含量的响应面图Fig.5Response surface plots of the effect of consumption of ammonium sulphate and ultrasonic time on the silymarin yield

图6 料液比和超声时间对水飞蓟中水飞蓟宾含量的响应面图Fig.6Response surface plots of the effect of sample/solvent ratio and ultrasonic time on the silymarin yield

表4 不同提取工艺对水飞蓟宾提取量的影响Table 4The effect of different extraction techniques on the silymarin yield

3 讨论

采用超声辅助双水相体系，利用星点设计-响应面法对水飞蓟中水飞蓟宾的提取工艺进行了优化，得到的最佳工艺条件为：乙醇体积分数为57%，硫酸铵的用量为0.26 g·mL-1，料液比为25 mL·g-1，超声时间为19 min。在最佳提取条件下水飞蓟宾的提取率可达到10.18 mg·g-1。实验结果表明乙醇-硫酸铵双水相体系具有溶剂价廉低毒易回收，避免使用高聚物等特点[12]，同时提高了水飞蓟宾的提取率，操作简便，适应于工业化生产。该研究结果为天然产物中有效成分的提取提供了一定的参考价值。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部［M］.北京：中国医药科技出版社，2010.

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Optimization of Ultrasonic-assisted Aqueous Two-phase System Extraction Silymarin from Silybum marianum（L.）Gaertn

Ruan Hongsheng1，2，Jia Guiyan1，Wu Zhijun1，Zheng Xiaoliang1
（1.Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.Zhejiang Pharmaceutical College）

To optimize the extraction technology of silymarin from Silybum marianum（L.）Gaertn，the independent variables were ethanol concentration，consumption of ammonium sulphate，sample/solvent ratio and ultrasonic time，the dependent variable was extraction rate of silymarin which was used to estimate the relationship between independent and dependent variables.Central composite design and response surface methodology，accompanied by ultrasonic-assisted aqueous two-phase system，was used to optimize the process of extraction.The optimum technological parameters were as follows：ethanol concentration 57%，consumption of ammonium sulphate 0.26 g·mL-1，sample/solvent ratio of 25 mL·g-1，and ultrasonic time 19 min.The highest extraction rate of silymarin was 10.18 mg·g-1，which was coincided with model predictions.The extraction technology was simple，reliable and highly predictive which could be used for extraction of silymarin from Silybum marianum（L.）Gaertn.

aqueous two-phase system；Ultrasonic extraction；Silybum marianum（L.）Gaertn；Silymarin

R283.6

A

1002-2090（2017）01-0059-05

2016-03-08

黑龙江省农垦总局科技攻关项目（HNK125B-13-04）。

阮洪生（1973-），男，副教授，黑龙江中医药大学毕业，现主要从事中药学的教学与研究工作。