CerbB-2、Ki-67基因蛋白在胃腺癌中的相关性及微转移中的意义*

闵 静

(湖北职业技术学院医学院，湖北 孝感 432000)

CerbB-2、Ki-67基因蛋白在胃腺癌中的相关性及微转移中的意义*

闵 静

(湖北职业技术学院医学院，湖北 孝感 432000)

目的 研究胃腺癌基因蛋白CerbB-2、Ki-67的临床意义、相关性及与微转移关系。方法 应用免疫组织化学法(IHC)对458例胃腺癌组、95例对照组，82例早期黏膜下胃腺癌淋巴标本中CerbB-2、Ki-67基因蛋白进行检测。结果 CerbB-2基因蛋白在胃腺癌组及对照组中的高表达率分别为32.3%、9.47%；Ki-67基因蛋白高增殖活性率则分别为48.7%、17.9%，存在显著性差异；CerbB-2表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、分化程度无相关性，而与TNM分期、浸润深度、转移有关；Ki-67的高增殖活性与患者年龄、性别、肿瘤大小无关，而与肿瘤分化程度、TNM分期、浸润深度、转移有关。CerbB-2、Ki-67检测结果具有相关性。82例早期黏膜下胃腺癌患者淋巴结基因蛋白Ki-67、CPK、CerbB-2高表达率分别为42.5%、42.5%、0%，82例中11例转移，27例淋巴结微转移，相比HE染色检出率明显增高。结论 CerbB-2、Ki-67基因蛋白与胃腺癌的发生、发展有明显的关联。Ki-67基因蛋白检测对微转移有意义，对早期发现胃腺癌有着极大意义；而CerbB-2不明显。

胃腺癌；CerbB-2；Ki-67；免疫组织化学；相关性；微转移

癌基因CerbB-2具有酪氨酸激酶活性，促进细胞有丝分裂，加速肿瘤细胞增殖，因而CerbB-2基因在胃癌组织中生物学特性研究将非常有意义，检测胃癌CerbB-2的表达，对指导临床，开拓治疗方法将具有很大意义。而Ki-67是一种核蛋白，由MKI-67基因编码，提示细胞的增殖活跃程度，与核糖体RNA转录有关，当Ki-67失活时核糖体RNA合成受限，是一种细胞增殖的标记物。Ki-67在细胞静止期G0期不表达，细胞增殖的各期(G1、S、G2和M)中均有表达，与肿瘤分化程度、浸润、转移及预后密切相关，是较为理想的检测细胞增殖活性的抗体[1-2]。本实验通过对胃腺癌CerbB-2及Ki67基因蛋白检测，研究其与胃腺癌的生物学行为的相关性，旨在为临床提供个体化治疗依据。

1 材料与方法

1.1 胃癌标本 458例标本均选自孝感市中心医院肿瘤外科2007-2014年间的胃腺癌患者,所有标本均为新鲜标本，观察组中男性249例、女性209例；年龄35.5～76.5岁,平均年龄56.6岁。样本离体后立即取材，于10%福尔马林溶液中固定。

纳入标准：①有完整病例资料；术前未经针对肿瘤的治疗；②常规行切片HE染色，证实非肿瘤胃黏膜无癌累及，肿瘤原发灶均经病理证实，转移灶系转移的癌组织；且癌细胞累及比例大于75%，以保证所取标本合格。

其中82例早期黏膜下I期胃腺癌患者中，50例高分化癌，32例低分化癌，肿瘤侵犯深度进行常规HE诊断，首先判断肿瘤侵犯深度确认早期黏膜下胃腺癌及分化程度，然后统计淋巴结转移及微转移。淋巴结免疫组化切片由高级病理医师进行诊断。双方结果进行对比并结合临床及病理学指标进行综合分析。将免疫组化(IHC)染色中发现，但HE染色未能诊断的淋巴结转移，且以边缘窦型单个、散在、或小细胞团簇为微转移病灶，PCK(cytokeratin pan,PCK)为广谱细胞角蛋白，是上皮来源肿瘤的可靠标志物，用PCK检测确认微转移，再作Ki-67、CerbB-2检测。

1.2 对照组标本 对照组的95例标本(随机)均取自距离肿瘤边缘5cm之外的非肿瘤胃黏膜组织。

1.3 主要实验仪器和试剂 电热恒温培养箱(Jc303型，上海成顺仪器仪表有限公司)；AS

LINK 48，Dako公司自动免疫组化仪；切片机 SHANDON FINESSE ME+；奥林巴斯显微镜CX41；试剂cerbB-2[克隆号EP3]；Ki-67[克隆号MIB-1](试剂由Dako公司提供)。

1.4 方法

1.4.1 免疫组化方法 EnVisionTM二步法：常规石蜡包埋、切片(切片厚度3μm)，65℃烤片2h，经二甲苯脱蜡以及梯度酒精水化后，用EDTA(10mM；PH 9.0)溶液高压锅进行抗原修复，经蒸馏水及PBS冲洗，3%H2O2封闭5min，再PBS冲洗后上免疫组化仪完成免疫组化染色，最后经苏木素复染，中性树胶封片。

1.4.2 免疫组化结果评定标准 CerbB-2判读手术标本：无反应或≤10%的肿瘤细胞膜染色为(0)；≥10%的肿瘤细胞微弱或隐约可见膜染色，仅有部分细胞膜染色为(1+)；≥10%的肿瘤细胞有弱到中度的基底膜、侧膜或完全性膜染色为(2+)；≥10%的肿瘤细胞基底膜、侧膜或完全性膜强染色为(3+)，把0、(1+)视为低表达，(2+)、(3+)视为高表达。Ki-67为核表达，在核着色密集区中倍镜下计数100个肿瘤细胞中Ki-67核表达的细胞数所占的百分比，计数的结果<10%视为(0)；10%～25%视为(1+)；25%～50%视为(2+)；>50%视为(3+)；0与(1+)视为增殖活性低，(2+)与(3+)视为增殖活性高。

1.5 统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件包进行分析，采用卡方检验，chi-square相关性分析。

2 结 果

458例胃腺癌癌标本中，肿瘤位于胃窦222例，贲门56例，胃体180例；高分化腺癌112例、中分化腺癌138例，低分化及未分化癌208例；年龄>60岁223例，年龄≤60岁235例；男性组249例，女性组209例；肿瘤小于5cm 266例，大于5cm 192例；TNM分期Ⅰ、Ⅱ期胃癌225例，Ⅲ、Ⅳ期胃癌233例；浆膜浸润118例，无浆膜浸润340例；无淋巴结转移342例，淋巴结转移116例；无远处转移362例，远处转移96例。

2.1 观察组与自身对照组CerbB-2、Ki-67基因表达比较 458例胃腺癌标本中，观察组与自身对照组CerbB-2、Ki-67基因表达高表达率均有统计学差异(P均<0.01)，见表1。

表1 两组标本中CerbB-2、Ki-67基因表达情况

2.2 CerbB-2、Ki-67基因蛋白高表达率与胃腺癌患者临床病理的关系 研究结果显示，CerbB-2、Ki-67基因蛋白表达在胃腺癌与自身对照正常组织间有明显差异(P<0.01)，见表1；CerbB-2基因蛋白表达高表达率与胃癌患者肿瘤的大小、分化程度、患者年龄、性别无相关性(P均>0.05)，而与肿瘤的临床分期、浸润深度、转移相关(P均<0.01)，见表2；Ki-67基因蛋白高增殖活性与胃癌患者肿瘤的大小、患者年龄、性别无关(P均>0.05)，而与肿瘤的临床分期、分化程度、浸润深度、转移有关(P均<0.01)，见表2。

表2 CerbB-2、Ki-67基因表达与胃腺癌患者临床的关系

2.3 CerbB-2、Ki-67基因表达相关性分析 胃腺癌患者CerbB-2、Ki-67基因蛋白表达情况结果显示，这两种基因蛋白的检测结果具有一致性，具有统计学意义(P<0.01)，Ki-67基因蛋白这项敏感度更高。详见表3。

表3 CerbB-2、Ki-67基因表达相关性分析

χ2=8.917,P<0.01

2.4 Ki-67、CerbB-2基因表达阳性率、平均淋巴结检出数与微转移淋巴结检出率情况 458例中共筛查82例标本患者早期黏膜下胃腺癌，用传统法检出淋巴结共1459枚，常规HE染色诊断48枚有转移，应用IHC法分别用PCK、Ki-67、CerbB-2进行验证检测淋巴结，用PCK(+)检测112枚存在微转移，Ki-67(+)，见图1(封三)。82例标本患者11例发生转移(11/82)，占比13.4%，另有27例淋巴结微转移，IHC法检测淋巴结Ki-67阳性率(38/82)，占比46.3%。再对112枚淋巴结进行CerbB-2检测，目前未有检测淋巴结微转移CerbB-2阳性者，见图2(封三)。

HE染色检测Ki-67的性率为13.4%(11/82)，HE染色+IHC检测阳性率为46.3%(38/42)，两者比较差异有统计学意义(P<0.01)。

3 讨 论

CerbB-2也称Her-2/neu基因，是一种原癌基因，它位于17q21上，其基因表达产物具有酪氨酸激酶活性作用[3]，正常情况下处于相对静止状态，当受到体内外各种诱因作用下，其结构和表达调控失常从而被激活，引起细胞增殖，从而导致细胞恶性转化。Ki-67基因蛋白在细胞静止期G0期不表达，在细胞增殖的各期(G1、S、G2和M)中均有表达，是较为理想的检测细胞增殖活性的抗体。多项有价值免疫组织化学指标的联合检测能提高检出率，并有助于临床分期，CerbB-2染色在细胞浆及细胞膜，Ki-67染色在细胞核，尤其Ki-67在细胞静止期G0期不表达，两者都为细胞增殖表现的抗体。本研究结果显示：CerbB-2基因的表达高表达率为32.3%。Ki-67基因蛋白的增殖活性高比率为48.7%，与报道[4]相近，CerbB-2、Ki-67基因蛋白在胃腺癌组织都明显增高(P<0.01)，这说明了CerbB-2、Ki-67基因蛋白与胃腺癌的发生存在密切关系。

本研究表明胃腺癌组织中CerbB-2基因蛋白的表达与胃腺癌患者的年龄、性别、肿瘤大小、分化程度无关(P均>0.05)，因而患者CerbB-2的表达具有一定程度的稳定性；其中CerbB-2与分化程度无相关性(P>0.05)可能与低分化胃癌的CerbB-2丢失有关。临床分期为Ⅲ期和Ⅳ期的胃腺癌患者，CerbB-2表达率明显高于Ⅰ期和Ⅱ期患者(P<0.01)，浆膜浸润明显高于无浸润者(P<0.01)，发生淋巴结转移及远处转移者明显高于无转移者(P<0.01)，提示CerbB-2基因蛋白表达高的胃腺癌患者预后不良。CerbB-2在胃腺癌中过表达预示疾病的结局更差，进展性更强。

实验表明Ki-67基因蛋白的增殖活性高与胃腺癌患者的年龄、性别、肿瘤大小无关(P均>0.05)，但与分化程度有关(P<0.01)；临床分期为Ⅲ期和Ⅳ期的胃癌患者Ki-67明显高于Ⅰ期和Ⅱ期患者(P<0.01)，浆膜浸润明显高于无浸润者(P<0.01)，发生淋巴结转移及远处转移者明显高于无转移者(P<0.01)。所以早期进行Ki-67基因蛋白检测，可以考虑作为指导分子靶向药物治疗的指标之一，Ki-67基因蛋白还可作为肿瘤的预后标记物并进行组织学分级[5]。Ki-67增殖活性高表明其增殖快，恶性度高，易转移、复发，术后考虑做化疗，如果切缘不在安全范围，临床还考虑放疗。

CerbB-2、Ki-67基因蛋白的检测结果具有一致性且其一致性具有存在统计学意义，相比较Ki-67基因蛋白敏感度更高，但不能用一种检测指标替代另外一种检测指标，应该联合检测提高检出率，对个体化治疗和预后评估有重要意义。

本研究还表明Ki-67基因蛋白检测能提高微转移检出率，临床上普遍应用的传统HE淋巴结检出方法容易漏检小淋巴结及微小淋巴结。目前淋巴结微转移的检测方法有多种，其中IHC法则是利用靶蛋白等在淋巴结内的染色程度，确定是否存在微小转移，它具有快速、准确、容易阅片等优点，能明显提高微转移的检出率[6]；注意做到全数检查胃癌区域淋巴结尤其注意微小转移灶，就能提高胃癌pN分期的准确度，进而重新评估pTNM分期，对临床诊断及治疗方法选择非常有意义[6]。研究更多有效检测微转移的基因将具有非常大的实用价值，本研究中Ki-67基因的表达对于发现微转移病灶并有助于选择合适治疗方案，而CerbB-2未发现微转移病灶。但要注意淋巴结检测可能出现转移后抗原修复丢失，淋巴结固定不及时，抗原修复失效，淋巴结微转移标本数量太少等对研究结论的干扰。注意标本及时送检，以保持其抗原性不丢失，还需做进一步研究。

总而言之，胃腺癌CerbB-2及Ki-67基因蛋白与胃腺癌的生物学行为的存在密切关系，其检测可以为临床的个体化治疗提供依据。

[1]韩军平.多药耐药基因产物及CerbB-2、ki-67在胃癌中的表达及其临床病理学意义[J].现代肿瘤医学,2011,11(19):2281

[2]GRAVALOS C,JIMENO A.HER2 in gastric cancer: a new prognostic factor and a novel therapeutic target[J].Ann Oncol，2008,19(9):1523

[3]李红，李乾，王祎萌，等.中晚期胃癌中ERCC1与CerbB-2的表达及临床[J].中国热带医学，2015，15(8):112

[4]许威.血清癌胚抗原、基质金属蛋白酶3、血管内皮生长因子与胃癌微转移及预后关系的研究进展[J].医学综述，2013，19(11):1982

[5]李常莹，赵瑞华，张伟杰，等.胃癌患者CEA与Ki-67的表达及意义[J].肿瘤基础与临床，2014，27(1):525

[6]李敏,陈建,蒋敏,等.基质金属蛋白酶-7表达与胃癌淋巴结微转移的关系[J].临床外科杂志,2013，21(4):209

The Correlation and the Significance of Micro Metastasis between CerbB-2 and Ki-67 Gene Protein Expression in the Gastric Adenocarcinoma

MIN Jing

(Medicalcollege,HubeiPolytechnicInstitute,XiaoganHubei432000China)

Objective To investigate the correlation and clinical significance of CerbB-2,Ki-67 gene protein in the gastric adenocarcinoma. Methods The CerbB-2 and Ki-67 gene protein were detected in 458 cases of gastric adenocarcinoma tissue,95 cases of the control tissue，82 cases of submucosal gastric adenocarcinoma lymph nodes by using immunohistochemistry.Results The positive rate of CerbB-2 expression in gastric adenocarcinoma tissues group and the control group were 32.3% and 1.05% respectively.The high proliferative activity of Ki-67 in tow groups were 48.7% and 17.9% respectively.There were significantly differences between two groups in the expressions of CerbB-2 and Ki-67 gene protein.The expression of CerbB-2 was not correlated with age,gender,tumor size or tumor differentiation,but was related to TNM stage,depth of invasion and metastasis The high proliferative activity of Ki-67 was not related to age,sex and tumor size,but was related to the degree of tumor differentiation,TNM stage,depth of invasion and metastasis.The results of CerbB-2 and Ki-67 were correlated The gene protein high expression rates of Ki-67,CPK,CerbB-2 in early gastric cancer lymph node in 82 cases with submucosal were 42.5%,42.5% and 0%.There were 11 cases of metastasis and 27 cases of lymph node micrometastasis in 82 cases.The detection rate increased significantly than HE staining.Conclusion CerbB-2 and Ki-67 gene protein can be considered as important index.The detection of Ki-67 gene protein is very significant for micrometastasis,which has great significance for early detection of gastric cancer，but CerbB-2 is not obvious.

Gastric adenocarcinoma；CerbB-2；Ki-67；Immunohistochemistry；Correlation analysis；Micro metastasis

湖北职业技术学院院级课题(2013B07)

R735.2

A

2095-4646(2017)01-0009-04

10.16751/j.cnki.2095-4646.2017.01.0009

2016-09-01)