固相萃取-高效液相色谱-荧光法测定人体尿液中单胺类神经递质

高 慧，邢 燕，汪 洋，宋金枝，王 旭

（1.淄博市疾病预防控制中心，山东 淄博 255026；2.杭州医学院，浙江 杭州 310053）

固相萃取-高效液相色谱-荧光法测定人体尿液中单胺类神经递质

高 慧1，邢 燕1，汪 洋1，宋金枝2，王 旭2

（1.淄博市疾病预防控制中心，山东 淄博 255026；2.杭州医学院，浙江 杭州 310053）

建立一种快速、准确测定人体尿液中肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺及5-羟色胺4种单胺类神经递质的方法。尿液样品以Waters Oasis WCX固相萃取柱富集，依次用2mL 20mmol/L乙酸铵-甲醇溶液、2mL甲醇淋洗杂质，最后用5mL含2%甲酸的乙腈水溶液（85∶15，ν∶ν）提取被分析物。经Agilent C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）分离，以甲醇与乙酸钠溶液的不同配比设置流动相梯度，在荧光检测激发波长280nm，发射波长340nm条件下，测定人体尿液中4种单胺类神经递质的含量。结果表明：4种单胺类神经递质的回收率为92.2%～104.8%，相对偏差为1.6%～3.1%，检出限为0.002～0.05μg/mL。该方法稳定、快速、简便，能满足人体尿液中多种单胺类神经递质的含量测定。

单胺类神经递质；固相萃取；高效液相色谱；荧光检测

0 引 言

神经递质是神经末梢分泌的化学物质，在化学突触传递中担当信使的作用。单胺类物质（MNTs）是最早发现的一类神经递质，包括多巴胺（DA）、肾上腺素（E）、去甲肾上腺素（NE）和5-羟色胺（5-HT）。MNTs在中枢神经系统、外周植物神经系统和激素介导的内分泌及外分泌活动中起着极其重要的作用[1]。固相萃取（solid-phase extraction，SPE）是近年发展起来的一种样品预处理技术，主要用于样品的分离、纯化和浓缩，与传统的液液萃取法相比较可以提高分析物的回收率，更可将分析物与干扰组分有效分离，正成为复杂样品纯化、富集的有效手段。

人体尿液中单胺类神经递质含量的准确检测，对嗜铬细胞瘤等相关疾病诊断、新药研制开发、药物疗效评价等方面有重要意义。由于人体尿液基质非常复杂，且单胺类神经递质在尿液中的含量较低，因此对检测方法的灵敏度和选择性都提出较高的要求。MNTs的检测方法主要有电化学分析法[2]、荧光法[3]、高效液相色谱-荧光检测法[4]、高效液相色谱-电化学检测法[5-6]、毛细管电泳法[7]、色谱-质谱联用法[8-9]。电化学分析法测定生物样品的稳定性较差，且修饰电极的使用寿命有限，灵敏度不高[2]；荧光法易受样品基质影响，稳定性也较差[3]；毛细管电泳法的重现性较差[7]。MNTs本身质谱响应信号不强，准确测定存在困难，且色谱-质谱联用法的仪器比较昂贵[8]。本研究旨在通过固相萃取柱将人体尿液中的单胺类神经递质进行选择性的萃取富集，采用高效液相色谱荧光检测法进行分析，建立一种快速、高效、准确测定尿中4种单胺类神经递质的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Waters e2695型高效液相色谱仪-荧光检测器（美国沃特世公司）；Agilent C18色谱柱（250mm× 4.6 mm，5 μm）、Waters XBridge C18柱 （250 mm× 4.6 mm，5 μm）、Waters Symmetry C18柱 （250 mm× 4.6 mm，5 μm）；微量注射器；固相萃取仪（美国色谱科）；CP 225D微量分析天平（德国赛多利斯）；Oasis HLB、Oasis WCX、Oasis WAX固相萃取柱（美国沃特世公司）。

标准品：重酒石酸去甲肾上腺素（美国 Sigma公司），酒石酸肾上腺素（上海阿拉丁试剂有限公司），多巴胺盐酸盐（上海源叶生物科技有限公司），5-羟色胺盐酸盐（上海源叶生物科技有限公司）；甲醇（HPLC级，美国默克公司）；乙腈（HPLC级，美国默克公司）；盐酸（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙酸铵（分析纯，天津化学试剂有限公司）；乙酸钠（分析纯，上海化学试剂总厂所属上海试剂四厂）；乙二胺四乙酸二钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；实验用水均为超纯水。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

反相液相色谱柱Agilent C18色谱柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；进样量为10 μL；荧光检测激发波长280 nm，发射波长340 nm；柱温为30℃；流动相及梯度洗脱程序如表1所示。流动相成分中缓冲液即为含0.1mmol/L乙二胺四乙酸二钠 （EDTA-2Na）的0.04mol/L乙酸钠溶液（pH 4）。

表1 流动相梯度表

1.2.2 样品的检测

1）样品预处理

取新鲜人体尿液2mL，加200μL 1mol/L的盐酸溶液将尿液进行酸化处理，随后加入2.0mL 0.5mol/L的乙酸铵，混匀，超声5 min后，以5 000 r/min离心10min。取上清液，经0.45μm滤膜过滤，滤液于4℃冰箱保存待用。

2）样品制备

就业关系到国计民生，直接影响社会稳定。中国由于经济结构调整，面临较大的就业压力。而旅游业是一个劳动密集型产业，在缓解就业压力方面起着重要作用。在旅游就业中，由于旅游非正规就业对教育和技能水平的要求不高，因此在吸收城镇失业人口和农村剩余劳动力方面发挥着重要的作用，而在旅游非正规就业中，存在着一种规模较大但又经常被人们忽视的就业类型——自我就业。

依次用5 mL甲醇、5 mL水活化Oasis WCX固相萃取柱。取上述处理过的尿样4 mL上样，流量为1 mL/min，依次用2 mL 20mmol/L乙酸铵-甲醇溶液、2mL甲醇淋洗杂质，最后用5mL含2%甲酸的乙腈水溶液（85∶15，ν∶ν）洗脱被分析物，流量为0.5mL/min。所得洗脱液氮吹至近干，用初始流动相复溶至1.0mL，经0.22μm滤膜过滤后，供HPLC分析。

1.2.3 标准溶液配制

准确称取EP、NE、DA和5-HT标准品各20mg，分别置于10mL容量瓶中，加入0.01mol/L的盐酸溶液，充分震荡使其溶解并定容至刻度，得质量浓度均为2000μg/mL的标准储备液，保存于4℃冰箱中。

1.2.4 标准曲线绘制

准确吸取EP、NE、DA和5-HT 4种标准储备液，用0.01mol/L的盐酸溶液稀释为EP 30.0 μg/mL、NE 50.0 μg/mL、DA 50.0 μg/mL和5-HT 20.0 μg/mL的标准应用液。分别准确吸取标准应用液0.01，0.05，0.30，1.00，2.00mL于10mL容量瓶中，初始流动相定容，用HPLC分析，绘制标准曲线。

1.2.5 测 定

取1.2.2方法制备的尿液上样，进行HPLC分析，保留时间定性，峰面积定量。

2 结果与讨论

2.1 固相萃取条件的选择及优化

固相萃取的效果取决于其填料类型[10]，本实验分别考察了亲水亲油平衡柱（Oasis HLB）、弱阳离子交换柱（Oasis WCX）和弱阴离子交换柱（Oasis WAX）对神经递质的萃取效果，结果见图1。表明4种单胺类神经递质在Oasis WCX柱有较好的保留，且回收率最高，杂质去除理想；Oasis HLB回收率次之，但干扰杂质去除不够理想；Oasis WAX回收率不理想。Oasis WCX柱为弱阳离子交换柱，可吸附带正电的分子。这4种神经递质极性比较弱，在中性条件下为不带电荷的分子，而在酸性条件下成为带正电荷的弱阳离子。

图1 不同固相萃取柱对提取回收率的影响

2.1.2 淋洗液的选择

尿样成分复杂，含有多种蛋白质和盐类化合物，会干扰目标化合物的洗脱，因此洗脱之前的净化步骤也很重要。本文考察了纯水、甲醇、5%氨水-水溶液、20 mmol/L乙酸铵-甲醇溶液4种不同溶剂作为淋洗液的去杂质效果，结果表明，先用2 mL 20mmol/L乙酸铵-甲醇溶液，再用2mL甲醇作为淋洗液时，能最大程度去除尿液中的尿酸及部分中性和碱性化合物的干扰，且对于4种单胺类神经递质在萃取柱有最大保留。

2.1.3 洗脱条件的优化

图2 不同洗脱液对提取回收率的影响

考察了2%甲酸-甲醇、2%甲酸-乙腈、含2%甲酸的乙腈-水（85∶15，ν∶ν）3种不同的洗脱溶液，结果如图2所示。结果表明用含2%甲酸的乙腈水溶液洗脱效率最高。洗脱液每次1mL进行洗脱，当用量为5 mL时，4种单胺类神经递质已完全洗脱，因此，本实验采用5mL含2%甲酸的乙腈-水溶液（85∶15，ν∶ν）作为洗脱液。

2.1.4 流量的优化

样品过柱流量也是优化目标化合物固相萃取效果必须考虑的因素，因本实验的目标样品为尿样，基于临床应用考虑和固相萃取柱的容量，样品体积一般不会大于10mL，而较小的流量一般都会对回收率提高有积极影响，因此本实验选择流量为0.5mL/min。

2.2 分离条件的优化

单胺类神经递质在水溶液中具有较高的溶解性，造成在一般反相色谱柱保留强度较弱[11]。为了提高稳定性和达到更好的分离效果，选择酸性溶液加入适量的有机相作为流动相。分别考察了乙腈和乙酸钠水溶液、甲醇和乙酸钠水溶液，发现甲醇和乙酸钠水溶液分离效果与峰形优于乙腈和乙酸钠水溶液，因此有机相选用了甲醇。为了减少溶液中金属离子的干扰加入了EDTA-2Na。

流动相的pH是离子对色谱分离的关键，4种单胺类神经递质在酸性条件下稳定性最佳，考察了流动相的pH 2.0～pH 4.0对样品出峰情况的影响，如图3所示，结果表明，在pH较小时峰分离不好，在pH 4.0时色谱分离效果最好，故选用pH 4.0的流动相分析。

2.3 色谱条件优化

分别考察了 Waters XBridge C18柱、Waters Symmetry C18柱和Agilent C18柱分离效果，发现Waters XBridge C18柱和Waters Symmetry C18柱对于分离EP和NE效果不够理想。Agilent C18柱对分析物分离效果最好，因此选用此色谱柱。

图3 流动相pH对分离效果的影响

选用紫外检测器，发现峰形过小，灵敏度太低，以致无法检出[12]。选用电化学检测器，发现其背景较高且基线波动较大，原因可能是其电极在分析过程中参与氧化还原反应，反应产物累积在电极表面使得检测灵敏度降低，低浓度分析物难以检出[13]。故改用荧光检测器，其基线平稳，选择性好，可有效分离分析物。用荧光检测器进行扫描，发现4种单胺类神经递质在激发波长和发射波长分别为280，340 nm附近有最大吸收峰，样品溶液杂质干扰小，检测灵敏度高，故定其为检测波长。尿液样品图谱与样品加标分离效果如图4所示。

图4 尿液样品图谱与样品加标分离效果图

2.4 方法学验证

2.4.1 线性范围及方法检出限

采用外标法，配制不同质量浓度的标准溶液进样测定，以峰面积为纵坐标，样品质量浓度为横坐标作图，绘制标准曲线，以3倍信噪比计算4种单胺类神经递质的检出限，结果见表2。线性范围和检出限可以满足嗜铬细胞瘤等相关疾病诊断的临床需求。

表2 EP、NE、DA和5-HT的标准曲线

2.4.2 方法的精密度和回收率

取健康人的混合尿，分别加入1，30，200 μL标准应用液，每一质量浓度平行制作5份，连续5d，按1.2.2方法萃取净化后，氮吹至近干，用初始流动相定容至1.0 mL，经0.22 μm微孔滤膜过滤后，用HPLC分析，每份测定3次，记录各种单胺类神经递质峰面积的平均值，代入当日标准曲线计算测得浓度，考察方法的日内精密度和日间精密度；将测得的各种单胺类神经递质色谱峰面积与相应质量浓度标准溶液直接进样测得的色谱峰面积对比，得方法的绝对回收率，结果见表3。日内、日间精密度对于嗜铬细胞瘤患者用药前后疗效对照具有重要的临床价值，绝对回收率满足了4种单胺类神经递质的检测要求。

表3 方法的精密度和准确度（n=5）

3 结束语

本文通过对尿液样品前处理条件和色谱分析条件的优化，选择了最佳检测条件，实现了对尿中4种单胺类神经递质的同时测定，具有操作简便、灵敏度高、检出限低、线性范围宽、杂质干扰少及结果准确可靠的优点。因尿液基质复杂，尿中4中单胺类神经递质含量较低，将尿液样品经盐酸溶液酸化处理后，在4℃冰箱保存一周结果无显著变化，对于临床患者尿液留存有实际意义。本文选用的Oasis WCX固相萃取柱既能实现尿液中复杂干扰物的去除，又能实现待测物的完全保留和洗脱，实现了HPLC-荧光检测器对4种单胺类神经递质的完全分离检测，满足了尿中单胺类神经递质的分析测试要求。

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（编辑：莫婕）

Determination of monoamine neurotransmitters in human urine by solid phase extraction-high performance liquid chromatography-fluorescence detector

GAO Hui1，XING Yan1，WANG Yang1，SONG Jinzhi2，WANG Xu2
（1.Zibo Center For Disease Control and Prevention，Zibo 255026，China；2.Hangzhou Medical College，Hangzhou 310053，China）

A rapid and accurate method for detecting pinephrine，norepinephrine，dopamine，serotonin hydrochloridein human urinewasdeveloped.Themonoamineneurotransmitterswere extracted from human urine samples with Waters Oasis WCX solid phase extraction（SPE）cartridges. Then 2 mL 20 mmol/L ammonium acetate-methanol solution，2 mL methanol were used for eluting impurities.Finally，the analyte were extracted by 5 mL acetonitrile-water solution（85∶15，ν∶ν）containing 2%formic acid.The separation was performed on Agilent C18 capillary column（250mm× 4.6 mm，5 μm）followed by different proportion of methanol and sodium acetate solutions gradient elution.Four monoamine neurotransmitters in human urine were detected by high performance liquid chromatography with fluorescence detection（excitation wavelength 280 nm， emission wavelength 340 nm）.The results showed the average recoveries were between 92.2%and 104.8%，the relative standard deviations were between 1.6%and 3.1%，and the limits of detection were between 0.002μg/mL and 0.05μg/mL.The method used in this study is stable，fast and easy.The method has practical value for detecting monoamine neurotransmitters in human urine．

monoamine neurotransmitter；solid-phase extraction；high performance liquid chromatography；fluorescence detection

A

：1674-5124（2017）02-0060-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2017.02.012

2016-10-10；

：2016-11-29

浙江省科技厅分析测试项目（2015C37009）；浙江省大学生创新科技计划（新苗项目）（2015R436003）；2014年浙江省高等学校访问学者专业发展项目（FX2014132）

高 慧（1979-），女，山东淄博市人，主管技师，研究方向为理化检验。

王 旭（1980-），女，山东聊城市人，教授，博士，主要从事卫生理化检验研究。