顶空固相微萃取-气相色谱/质谱法结合保留指数法测定龙井茶的香气成分

胡西洲，彭西甜，周有祥，赵明明，严 伟，龚 艳，胡定金

（湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，湖北 武汉 430064）

顶空固相微萃取-气相色谱/质谱法结合保留指数法测定龙井茶的香气成分

胡西洲，彭西甜，周有祥，赵明明，严 伟，龚 艳，胡定金

（湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，湖北 武汉 430064）

采用顶空固相微萃取（headspace solid phase micro-extraction，HS-SPME）和气相色谱-质谱（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）结合保留指数法分析龙井中的挥发性成分。以茶叶香气成分的种类和数量为参照，考察HS-SPME的最佳萃取条件；同时优化色谱分离条件；利用优化的HS-SPME-GC/MS条件分析龙井茶中的挥发性成分。结果表明，运用HS-SPME-GC/MS能有效测定龙井茶中的挥发性成分，这些挥发性成分中主要含有醇类（31.14%）、酯类（15.66%）、酮类（10.42%）、杂环类化合物（15.00%）等。顶空固相微萃取-气相色谱质谱法结合保留指数分析是一种快速有效分析龙井茶香气成分的方法，可提高定性分析的准确性和效率，使定性结果更加可靠。该定性分析方法也为其他复杂样品中挥发性成分分析提供参考。

顶空固相微萃取；气相色谱/质谱；保留指数法；龙井茶；香气成分

0 引 言

茶叶香气成分是鉴别茶叶品质的重要指标，受到业界的广泛关注。茶叶香气是茶鲜叶在制作过程中通过复杂的生化反应而产生的，香气成分的组成、含量与不同的茶树品种、栽培环境、加工工艺、茶叶储存时间、温度等息息相关。任何一种茶叶的香气都是由不同物质以不同浓度组合的综合表现，而呈香物质间的相互作用也会对整体香型有显著的影响[1]。

据统计，已从各类茶叶中分离出700多种香气成分，主要包括醇类、酯类、醛类、酮类、酸类、酚类、杂环化合物、含硫化合物、含氮化合物、碳氢化合物等10大类化合物[1-2]。茶叶香气通常由感官技术来评价，尽管GB/T 23776——2009《茶叶感观评审方法》已对其作了详细规定，但评审结果容易受评审人员主观判断的影响。随着现代仪器分析飞速发展，准确分析茶叶代谢物指纹图谱，结合各种化学计量方法，已成为茶叶香气组分鉴定和品质预测的重要手段[3-5]。

保留指数（retention index，RI）是由 Kovats于1958年首次提出，该指标反映了化合物与固定相间相互作用，作为一种稳定的色谱定性参数，具有很好的准确度和重现性，可用于化合物的鉴定[6-7]。

龙井茶作为中国十大名茶之一，有着1200多年历史，按照传统工艺在地理标志产品保护范围内加工而成，是一种具有“色绿、香郁、味醇、形美”的扁形绿茶[8]。本研究采用顶空固相微萃取（headspace solid phase micro-extraction，HS-SPME）和气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）结合保留指数法快速分析龙井茶香气成分的方法，通过与谱库检索进行有效结合，提高了定性分析的准确性和可靠性。

1 仪器与材料

1.1 仪器

7890N-5975型气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent公司）；手持固相微萃取器，配50/30 μm CAR/ DVB/PDMS、100 μm PDMS、65 μm PDMS/DVB萃取头 （美国Supelco公司）；PC-420D恒温数显磁力搅拌器（美国Corning公司）。

1.2 试剂

正构烷烃标准品（C8～C32，美国Supelco公司）；癸酸乙酯（98%，国药集团化学试剂有限公司）。

1.3 试验材料

龙井茶样品采自杭州西湖龙井茶核心区。样品经粉碎后过20目筛，密封保存，待测。

2 方 法

2.1 GC-MS分析条件

GC条件：进样口温度为230℃；载气为高纯氦气（纯度99.999%）：柱流量为1.0mL/min；不分流进样。

程序温度1：首先以50℃保持5min；以3℃/min的速率升温至125℃，保持3min；再以2℃/min的速率升温至180℃，保持3 min；再以15℃/min的速率升温至230℃。

程序温度2：首先以70℃保持1min；以3℃/min的速率升温至120℃，保持2min；再以5℃/min的速率升温至180℃，保持20min。

程序温度3：首先以40℃保持2min；以2℃/min的速率升温至185℃；再以5℃/min的速率升温至210℃，保持40min。

程序温度4：首先以40℃保持1min；以2.5℃/min的速率升温至130℃，保持1min；再以8℃/min的速率升温至250℃，保持1min。

程序温度5：首先以50℃保持5min；以3℃/min的速率升温至125℃，保持3min；再以2℃/min的速率升温至180℃，保持3 min；最后15℃/min的速率升温至230℃，保持5min。

MS条件：电子电离源（EI）；离子化电压为70eV；离子源温度为200℃；四级杆温度为150℃；接口温度为280℃；质谱扫描范围为35～450amu。

2.2 SPME操作方法

准确称取1.0 g经粉碎后茶叶于15 mL的顶空瓶中，加入20 μL 10 mg/L癸酸乙酯标准溶液，再加入10mL沸水，密封，60℃水浴下磁力搅拌萃取，再将已经老化的CAR/DVB/PDMS萃取头穿透密封垫插入顶空瓶内茶汤上方，固定好SPME手柄，小心推出纤维头开始萃取并计时，60min后取出，然后插入气相色谱进样口，在230℃下热解吸5min。

2.3 定性与定量分析方法

定性：1）各组分峰与NIST12.L谱库中标准化合物的匹配度；2）化合物的保留指数；3）查阅香气成分的相关文献。定量：利用面积归一法计算得到各组分的相对含量。

2.4 保留指数的测定

单一线性程序升温的条件下保留指数计算式为

式中：RI——待测组分的保留指数；

RTunknown——待测组分的保留时间；

RTn、RTn+1——待测组分前后正构烷烃的保留时间；

n——正构烷烃的碳原子数。

3 结 果

3.1 固相微萃取条件的优化

3.1.1 固相萃取涂层的选择

比较了3种萃取头对龙井茶中挥发性成分的萃取效果，试验结果表明，PDMS萃取涂层由于适用于小分子非极性挥发性化合物，萃取效果最差。PDMS/DVB萃取涂层则适用于萃取极性挥发性物质，萃取效果较好。CAR/DVB/PDMS萃取头结合了以上两种萃取头的优点，具有更好的萃取效果，因此选择萃取头CAR/DVB/PDMS作为龙井茶香气成分的萃取材料。

3.1.2 萃取温度的优化

萃取温度是影响萃取速度的重要指标，当温度升高时有利于提高分析物的扩散速率，从而增加萃取速率；而萃取温度过高会降低分析物的分配系数，因此选取40，50，60，70，80℃进行萃取。结果如图1所示：随着萃取温度增加，峰数和峰面积均逐渐增加，当萃取温度达到60℃时峰面积达到最大，随着温度进一步增加，解吸附速率增加，总峰面积开始降低，选择60℃作为萃取温度。

图1 萃取温度对峰数和峰面积的影响

3.1.3 萃取时间的优化

萃取时间是指达到或接近平衡所需要的时间，在萃取的初始阶段，待分析组分很快富集到固相微萃取的纤维头上，但是随着萃取时间的延长，富集速度越来越慢。比较了萃取时间分别为20，30，40，50， 60，70，80min时的萃取效果，结果如图2所示：随着萃取时间增加，峰数和峰面积均逐渐增加，当萃取时间达到60min后峰面积变化很小，选择60min作为萃取时间。

图2 萃取时间对峰数和峰面积的影响

3.1.4 解吸附条件的优化

萃取完成后将萃取头置于气质联用仪的进样口分别解吸附1，3，5，7，9min，比较不同解吸附时间下龙井茶挥发性成分的变化情况。结果表明，解吸附时间为5 min时，各挥发性物质的峰面积达到最大，而后增加解吸附时间，峰面积不会增加且峰型变差。选择5min作为解吸附时间。

3.2 色谱分离条件的优化

选用一根30 m长的DB-5MS毛细管柱对龙井茶挥发性成分进行分离，探讨不同的升温程序对分离效果的影响，同时考虑色谱分离时间的问题，分离时间过长对于色谱定量和分析效率会有一定的负面影响。

按照2.1中温度程序考察色谱分离效果。通过分析，确定温度程序5是比较适合的温度程序，龙井茶挥发性组分分离相对较好，如图3所示。

3.3 龙井茶挥发性成分的测定

采用顶空固相微萃取模式，对杭州核心区的龙井样品的香气成分进行分析，对各色谱峰进行谱库检索，并根据混合正构烷烃和色谱峰的保留时间计算各组分的保留指数。根据谱库检索结果，结合参考文献的保留指数值对龙井样品的香气成分进行了鉴定，共得到49种化合物，再运用面积归一化法得到各组分的百分含量，结果见表1。由结果分析可知，龙井样品的香气成分十分复杂，且相对含量差异较大，主要包括烯烃类 （5.22%）、醇类 （31.44%）、酯类（15.66%）、醛类 （6.82%）、酮类 （10.42%）、酚类（7.18%）、胺类（3.55%）、烷烃类（4.46%）、芳香烃类（0.55%）和杂环类化合物（15.00%），其中醇类、酯类、杂环类化合物含量占主导地位。

表1 龙井茶香气成分分析结果1）

图3 程序升温5测得龙井茶香气成分总离子流图

在已鉴定的香气组分中排名前5位的分别为：芳樟醇（13.68%）、甲氧基苯基肟（11.14%）、(Z)-3-己烯醇己酸酯（7.19%）、4-氨基-2-甲基苯酚（6.27%）、3,5-辛二烯-2-酮（5.23%）。芳樟醇及其氧化物是所有组分中含量最高，总量达到17.23%。芳樟醇、2-乙基己醇、1-辛烯-3-醇、香叶醇是主要醇类化合物，相对含量分别为13.68%、4.41%、3.89%、3.03%。顺-3-己烯醇-己酸酯、顺-3-己烯醇-丁酸酯、顺-3-己烯醇-乙酸酯为酯类化合物中主要呈香物质，含量分别为7.19%、2.67%和2.37%。顺-3-己烯醇-己酸酯具有强烈弥散性梨香。另外，含量较高的有带有紫罗兰香气的β-紫罗酮（1.09%）、茉莉花香型的茉莉酮（2.44%）。此外，如柠檬烯（0.10%）、α-松油醇（0.40%）、α-紫罗酮（0.13%）、己酸-（E）-2-己醇酯（0.20%）含量相对较少，但含量少的物质未必对其香气的贡献一定小，任何香气都是由不同组成和含量的化合物及其相互间作用共同体现[1-3，9]。

4 结束语

本文以西湖核心区域的龙井茶为研究对象，利用HS-SPME和GC/MS结合保留指数法快速准确分析其挥发性香气成分，分析结果具有较高的准确性和重现性，显示出较大的优越性。该方法弥补了常规GC-MS谱库检索定性或者通过保留指数定性方法的不足，将谱库检索与保留指数结合，提高了复杂化合物定性分析的准确性和效率，使定性结果更加可靠。该分析方法也为其他复杂样品中挥发性成分分析提供参考。由于茶叶香气组分的组成和含量与茶树品种、栽培环境、加工工艺、茶叶储存时间、温度等密切相关，下一步将利用此分析方法结合统计学手段围绕不同区域、不同保存条件、时间和掺伪开展茶叶香气成分的指纹图谱研究。

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（编辑：莫婕）

Determination of aroma components from Longjing tea by headspace solid phase micro-extraction and GC-MS combined with retention index

HU Xizhou，PENG Xitian，ZHOU Youxiang，ZHAO Mingming，YAN Wei，GONG Yan，HU Dingjin
（Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology Research，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China）

A headspace solid phase microextraction-gas chromatography/mass spectrometry（HSSPME-GC/MS）method combined with retention index was used to analyze aroma components from Longjing tea.The optimal extract conditions were evaluated according to the kinds and amounts of aroma compounds from Longjing tea，and the chromatographic separation conditions were also investigated.Under the optimal conditions，aroma components from Longjing tea were identified by mass spectral library searching combined with retention index comparison.The results showed that the HS-SPME-GC/MS method could identify aroma components from Longjing tea effectively，mainly including alcohols(31.14%)，esters(15.66%)，ketones(10.42%)，and heterocyclic compounds(15.00%). This method is a fast，accurate，effective way to obtain aroma components from Longjing tea，which will facilitate qualitative analysis，and provide reference for analysis of volatile components from other complex samples.

HS-SPME；GC-MS；retention index；Longjing tea；aroma components

A

：1674-5124（2017）02-0055-05

10.11857/j.issn.1674-5124.2017.02.011

2016-07-29；

：2016-09-28

公益性行业（农业）科研专项（S201203046）；湖北农业科技创新中心项目（2016-620-000-001-037）

胡西洲（1979-），男，湖北监利县人，副研究员，博士，主要从事农产品质量安全及风险评估工作。

胡定金（1964-），男，湖北团风县人，研究员，主要从事农产品质量安全及风险评估研究。