重组人凝血因子Ⅷ细菌内毒素检测方法研究

范林，刘晓民，黄洁，徐武，刘鑫

（1.四川大学生命科学学院，四川成都610041；2.成都蓉生药业有限责任公司，四川成都610041）

重组人凝血因子Ⅷ细菌内毒素检测方法研究

范林1，2，刘晓民2，黄洁2，徐武2，刘鑫2

（1.四川大学生命科学学院，四川成都610041；2.成都蓉生药业有限责任公司，四川成都610041）

为建立重组人凝血因子Ⅷ细菌内毒素检查方法，按《中国药典》2015年版（二部）附录收载的细菌内毒素检查方法及指导原则开展试验。结果表明，鲎试剂动态浊度法在适当的稀释倍数下，重组人凝血因子Ⅷ细菌内毒素检测方法准确可靠，可以用于对重组人凝血因子Ⅷ原液、半成品、成品的检定，且不受人员、仪器和日期的影响。

细菌内毒素；重组人凝血因子Ⅷ；鲎试剂

据报道，我国的甲型血友病患者约10万人，其中1万人接受过凝血因子Ⅷ治疗[1]。目前，市场上有国内厂家从血浆中提取生产的凝血因子Ⅷ和进口的重组凝血因子Ⅷ。受原料血浆的限制，血浆来源的凝血因子Ⅷ产量十分有限，进口重组凝血因子Ⅷ价格昂贵，一般血友病患者无法承受。因此，迫切需要国内重组人凝血因子Ⅷ自主生产的完成。在重组人凝血因子Ⅷ的生产过程中，对其质量控制方法的建立也迫在眉睫。其中，建立细菌内毒素检测方法对控制产品的热原很重要。因此，必须建立一个快速检测细菌内毒素的方法。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

移液器、动态试管仪、无热原取样瓶、反应管、无热原玻璃试管、无热原吸头和螺旋震荡器。细菌内毒素工作标准品（CSE，效价60EU/支，批号150601-201479，中国食品药品检定研究院），鲎试剂（TAL，灵敏度0.015～10EU/mL，批号1306212，湛江安度斯生物有限公司），细菌内毒素检查用水（批号1403210，湛江安度斯生物有限公司）。重组人凝血因子Ⅷ原液、半成品和成品。

1.2 试验方法

1.2.1 供试品的最大有效稀释倍数（MVD）

取重组人凝血因子Ⅷ原液、半成品和成品，用细菌内毒素检查用水进行不同倍数稀释，且每一稀释倍数同时进行内毒素回收试验，将回收率最接近100%的稀释倍数确定为样品的最佳稀释倍数。

动态浊度法的鲎试剂灵敏度为0.03EU/mL（标准曲线的最低点），那么最大有效稀释倍数MVD=L/λb=5/0.03=166倍。

1.2.2 可接受标准

取供试品，采用2.2中专属性确认确定的最佳有效稀释倍数进行稀释，由2位操作人员分6d分别进行测定，每天各测定1次。通过仪器软件自动计算出供试品溶液的内毒素含量和供试品阳性对照溶液的细菌内毒素的回收率。取2人共12次测定结果计算其相对标准偏差（RSD）。对测定结果进行方差分析，对人员和日期两因素进行F检验。同时，用进口鲎试剂进行同样确认。

|r|≥0.98，供试品阳性对照溶液的细菌内毒素回收率应在50%～200%范围内。

1.2.3 可接受标准

（1）|r|≥0.98，供试品阳性对照溶液的细菌内毒素回收率应在50%～200%范围内。

（2）RSD≤20%。经F检验后，人员和日期两因素在α＝0.05水平上均对方法精密度无显著性影响（P＞0.05）。

2 结果与分析

2.1 稀释倍数试验

表1结果表明，重组人凝血因子Ⅷ原液，在低倍数（10倍）稀释时出现浑浊，为避免干扰试验，最终选择80倍稀释作为重组人凝血因子Ⅷ原液的最佳稀释倍数。

表2结果表明，重组人凝血因子Ⅷ半成品，在10倍稀释时回收率超出50%～200%范围，最终选择40倍稀释作为重组人凝血因子Ⅷ半成品的最佳稀释倍数。

同一产品不同组分的样品对试验的干扰情况各有不同，因此试验得出的稀释最佳试验倍数也有差异，若采用凝胶法来检测，那么需要进行供试品干扰试验，然后才能进行供试品检测，但供试品的干扰试验往往不是一次就能成功的[2]。而采用本方法只需要一次就能确定重组人凝血因子Ⅷ原液、半成品、成品的最佳稀释倍数。

2.2 专属性确认

表3结果表明，重组人凝血因子Ⅷ成品，在20倍稀释时回收率已接近100%且趋于稳定，最终选择20倍稀释作为重组人凝血因子Ⅷ成品的最佳稀释倍数。

2.3 中间精密度确认

表4结果表明，|r|≥0.98，供试品阳性对照溶液的细菌内毒素回收率在50%～200%范围内；RSD≤20%。经F检验后，人员、仪器和日期三因素在α＝0.05水平上均对方法精密度无显著性影响（P＞0.05）。

Study on Bacterial Endotoxin Test Method of Recombinant Human Coagulation Factor Ⅷ

Fan Lin1,2, Liu Xiao-min2, Huang Jie2, Xu Wu2, Liu Xin2
(1.College of Life Sciences, Sichuan University, Sichuan Chengdu 610041; 2.Chengdu Rongsheng Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan Chengdu 610041)

In order to establish bacterial endotoxin test method of recombinant human coagulation factor Ⅷ, the test was carried out according to the bacterial endotoxin test method and the guiding principle in the appendix of Chinese Pharmacopoeia (2015 Edition) (two). The results showed that under the appropriate dilution multiple, the bacterial endotoxin test method of recombinant human coagulation factor Ⅷ was accurate and reliable, can be used for verification of recombinant human coagulation factor Ⅷ solution, semi-finished products and finished products, which is not affected by personnel, equipment and dates.

Bacterial endotoxin; Recombinant human coagulation factor Ⅷ; Limulus reagent

表1 重组人凝血因子Ⅷ原液的专属性确认

表2 重组人凝血因子Ⅷ半成品的专属性确认

表3 重组人凝血因子Ⅷ成品的专属性确认

R446.112

A

2096-0387（2017）01-0019-03

范林（1985-），男，四川德阳人，本科，研究方向：蛋白提取。