GrNPV病毒的扩增及与生物农药的复配

王金昌，曾小琴，靳亮，占智高

（1.江西省科学院微生物研究所，江西南昌330096；2.抚州洋洲中心小学，江西抚州344000）

GrNPV病毒的扩增及与生物农药的复配

王金昌1，曾小琴2，靳亮1，占智高1

（1.江西省科学院微生物研究所，江西南昌330096；2.抚州洋洲中心小学，江西抚州344000）

本试验扩增了草原毛虫核型多角体病毒GrNPV。初步的生测试验表明，1×108、5×107、1×107、5×106PIB/mL和1×106PIB/mL的GrNPV对草原毛虫的致死中时间KT50都为4d左右。生物农药筛选试验表明，噻虫啉和阿维菌素对草原毛虫的致死率较高，死亡率分别为97.60%和88.60%。GrNPV可减少阿维菌素乳油和噻虫啉的用量，同时提高草原毛虫的死亡率。GrNPV与阿维菌素乳油或噻虫啉复配具有很好的杀虫效果。

草原毛虫；草原毛虫核型多角体病毒；生物防治

草原毛虫为我国高原牧区的重要害虫，别名红头黑毛虫、草原毒蛾，属于鳞翅目、毒蛾科[1]。草原毛虫主要为害莎草科、禾本科、豆科、蓼科、蔷薇科等各类牧草，草原毛虫爆发时危害严重，将牧草的大部分茎叶吃光，只剩下枯枝残叶，影响牧草生长，造成草原缺草，从而严重地影响畜牧业的发展[2]。草原毛虫不仅危害牧草，而且对人畜也有一定的影响，其体毛和茧毛有剧毒，牛羊采食了带虫或茧的牧草，会引起口腔黏膜红肿，发生小泡，齿根或舌头糜烂等[3，4]。

草原毛虫核型多角体病毒GrNPV（Gynaephora ruoregensis Nuclear Polyhedrosis Virus）对灭草原毛虫有较强的毒力，GrNPV对人体和脊稚动物无感染性、致病性和其他毒性[5]，而且能够通过水平扩散和垂直传递在害虫种群内形成病毒。刘世贵等[6]于1982-1983年在川西北草原发现和采集的自然死亡的草原毛虫尸体，首次分离和筛选而获得GrNPV，初步生测试验表明GrNPV对草原毛虫具有较强的感染致死能力。刁治民[7]于1987年从青海省海北州草地上罹病死亡青海草原毛虫幼虫分离获得GrNPV，试验结果显示GrNPV对草原毛虫有较强的毒力，其杀虫效果达85%，并有后效作用。国外也有草原毛虫感染核型多角体病毒的报道[8]，但无用核型多角体病毒进行防治的报道。

近年来，尕海一则岔自然保护区及周边地区发生了严重的草原毛虫灾害，尕海草原毛虫属于金黄草原毛虫。草原毛虫与牲畜争食，极大地降低了草地的载畜能力，加剧了畜草矛盾，给当地畜牧业生产造成严重损失，同时也严重威胁着保护区草地生态环境的安全。目前，防治草原毛虫大多用水溶性化学农药。但是，草原牧场长期施用化学农药导致草原毛虫抗药性增强，天敌数目减少，而且造成了草原污染环境，破坏了生态平衡以及产生农药残留增等问题。同化学防治相比，以生物农药和病毒为代表的生物防治技术具有对目标害虫特异性好、对环境无毒无害、害虫不容易产生抗药性等优点。杨志荣等[9]把GrNPV与苏云金杆菌B13混合再添加入一些辅助成分制成一种复合的V·B草原毛虫生物防治剂，用量50mL/667 m2，温度20℃左右时对3龄草原毛虫的防治效果达80%以上，能有效地防治草原毛虫。为此，本文开展GrNPV扩增、生测和与生物农药复配试验。

1 试验部分

1.1 试验材料

1.1.1 生物材料

供试草原毛虫幼虫，尕海高寒草地采集的2龄草原毛虫幼虫；养虫器皿，21L茶花带盖塑料水桶。

人工饲料，采于尕海高寒草地新鲜的带根垂穗披碱草和草地早熟禾，饲喂前用无菌水洗涤3次，晾干，用紫外线照15min；GrNPV病毒，中国科学院武汉病毒所馈赠。

1.1.2 药剂与器材

2.8 %阿维菌素乳油，黑龙江省绥化农垦晨环生物制剂有限责任公司；60g/L乙基多杀菌素悬浮剂，美国陶氏益农公司；32 000IU/mg苏云金芽孢杆菌，武汉科诺生物科技股份有限公司；40%毒死蜱乳油，江苏辉丰农化广丰有限公司；3%噻虫啉，南通功成精细化工有限公司；150亿个孢子/g球孢白僵菌，江西天人生态股份有限公司。普兰迪背负式12AH电动喷雾器3WDB-16L，石家庄市普兰迪机电设备有限公司；镊子、1m2样方框（自制）和标志旗等。

1.1.3 试验地

甘肃尕海，地理坐标为北纬33°58′12″～34°32′16″，东经102°05′00″～102°47′39″。

1.2 GrNPV病毒试验

1.2.1 GrNPV病毒室内增殖试验

在尕海高寒草地采集的2龄草原毛虫幼虫，用垂穗披碱草和草地早熟禾喂养至3龄期。增殖时选用100头健壮、发育整齐一致的3龄草原毛虫幼虫。把GrNPV病毒原液用无菌水稀释至3×106PIB/mL，用塑料喷壶喷洒到垂穗披碱草和草地早熟禾上，阴干后放入21L茶花带盖塑料水桶内，接入3龄草原毛虫幼虫。25℃，光照周9∶15饲养至草原毛虫全部死亡。期间每天注意观察，饲毒48h后换上新鲜的草料，及时取出伸直死亡的病死毛虫置4℃冰箱保存。

1.2.2 GrNPV病毒的提取

取病死虫尸中肠，加少量无菌水，在无菌研钵中研磨，差速离心研磨液2次（4 000rpm离心25min后500rpm离心30s），在光学显微镜（10×100）下，用血球计数板计数，病毒液置4℃冰箱保存。

1.2.3 GrNPV的室内生测试验

将灭菌后的粗提多角体加适量无菌水摇匀计数后配成所需要的浓度如下：1×108、5×107、1×107、5×106、1×106、5×105、1×105、5×104PIB/mL和1×104PIB/mL 9个浓度。每头以20μL用移液器吸取滴于1cm2的叶面上，涂匀晾干，进行喂饲试验。每浓度一组，每组24头幼虫，分别放在消毒的容器内，瓶口用湿纱布扎紧，涂无菌水作对照，重复3次。感染24h检查各组叶片全部吃光时，然后加入新鲜清洁叶片继续饲养。按试验要求进行观察记载[10]。计算死亡率，所得数据应用SPSS软件进行方差分析，应用SPSS软件的Probit进行线性回归分析，计算各不同病毒浓度的致死中时间（KT50）[11]。

1.3 GrNPV病毒与其他生物农药复配筛选试验

1.3.1 生物农药筛选试验

选择草原毛虫密度适中且分布相对均匀的危害区为试验区，施药时绝大多数草原毛虫个体处在3蛉期[12，13]。

设立6个实验区，各区使用的药品和用量如下：1区药品为2.8%阿维菌素乳油，喷药剂量为1 000mL/hm2；2区药品为60g/L乙基多杀菌素悬浮剂，喷药剂量为300mL/hm2；3区药品为苏云金芽孢杆菌可湿粉剂，喷药剂量为500g/hm2；4区药品为40%毒死蜱乳油，喷药剂量为1 000mL/hm2；5区药品为3%噻虫啉，喷药剂量为1 600mL/hm2；6区药品为150亿个孢子/g球孢白僵菌，喷药剂量为3 000g/hm2。同时，设立空白对照区。计算施药前及施药5d后各区草原毛虫数量，得出校正死亡率。

1.3.2 GrNPV病毒与其他生物农药复配筛选试验

在GrNPV的室内生测试验和生物农药筛选试验的基础上，选择适宜的生物农药与适宜浓度的GrNPV病毒进行复配试验。

2 结果与讨论

2.1 草原毛虫核型多角体病毒GrNPV病毒扩增结果

草原毛虫幼虫感染GrNPV病毒16d后全部死亡，取病死虫尸中肠研磨后差速离心提取GrNPV，GrNPV镜检结果见图1。

图1 GrNPV镜检图

2.2 GrNPV病毒生测结果

GrNPV病毒生测结果如表1所示。将表1用SPSS软件进行方差分析，结果见表2。F=1 692.923＞F0.01（8，32）=3.23，说明不同浓度GrNPV对草原毛虫的致死作用效果差异显著。

应用SPSS软件的Probit逐一对表1中不同浓度GrNPV对草原毛虫的致死时间进行线性回归分析，拟合优度检验，根据回归方程计算出不同浓度GrNPV的致死中时间KT50，结果见表3。

表1 GrNPV对草原毛虫幼虫感染致死的校正死亡率

表2 GrNPV不同浓度不同时间对草原毛虫幼虫死亡率方差分析

表3 不同浓度GrNPV对草原毛虫的致死时间的Probit分析结果

从表3可知，1×108、5×107、1×107、5×106、1×106PIB/mL的GrNPV对草原毛虫的致死中时间KT50相差不大，都为4d左右，故选用1×106PIB/mL的GrNPV作为与其他生物农药复配试验的工作浓度。

2.3 生物农药筛选试验结果

生物农药筛选试验结果见图2所示。

图2 不同农药对草原毛虫的校正致死率图

从图2可见，噻虫啉和阿维菌素阿维菌素对草原毛虫的致死率较高，校正死亡率为分别为97.60%和88.60%。故选择噻虫啉和阿维菌素与GrNPV病毒进行复配试验。

2.4 GrNPV病毒与其他生物农药复配筛选试验结果

GrNPV病毒与其他生物农药复配筛选试验设立4个试验区，1区喷施2.8%阿维菌素乳油，喷药剂量为1 000mL/hm2；2区喷施3%噻虫啉，喷药剂量为1 600mL/hm2；3区为1×106PIB/mL GrNPV+3%噻虫啉，GrNPV喷药剂量为500mL/hm2，噻虫啉喷药剂量为800mL/hm2；4区为1×106PIB/mL GrNPV+2.8%阿维菌素乳油，GrNPV喷药剂量为500mL/hm2，阿维菌素乳油喷药剂量为500mL/hm2。计算施药前及施药5d后各区草原毛虫数量，得出校正死亡率。GrNPV病毒与噻虫啉和阿维菌素复配筛选试验结果见图3。

图3 不同农药对草原毛虫的校正致死率图

从图3可见，GrNPV可减少阿维菌素乳油和噻虫啉的用量，同时提高草原毛虫的死亡率：3区阿维菌素乳油的用量是1区阿维菌素乳油用量的1/2，草原毛虫的校正死亡率从88.60%提高到95%；4区噻虫啉用量是2区噻虫啉用量的1/2，草原毛虫的校正死亡率都维持在90%以上。

3 结论

阿维菌素和噻虫啉均是一种高效、低毒和无公害的生物杀虫剂，对主要牧草嵩草科、禾本科等均无药害现象，说明该药剂对牧草安全，具有大规模推广应用的必要性[14]。本试验把GrNPV与阿维菌素乳油或噻虫啉复配、扩增GrNPV，把GrNPV与阿维菌素乳油或噻虫啉复配，减少了阿维菌素乳油和噻虫啉的用量，同时提高草原毛虫的死亡率，能有效杀灭草原毛虫，对人畜无害，不污染环境，而且能够在草原毛虫种群内进行水平扩散和垂直感染，具有很好的开发应用前景。

[1]张棋麟,袁明龙.草原毛虫研究现状与展望[J].草业科学,2013, 30(4):638-646.

[2]马利青.草原毛虫的研究进展[J].青海畜牧兽医杂志,2013, 43(1):40-42.

[3]刘文清,河生德,尼玛.不同条件下草原毛虫引起放牧家畜口膜炎的危害性调查[J].中国草食动物,2011,31(1):51-52.

[4]尼玛,河生德,李长云.草原毛虫引起牦牛口膜炎的防治[J].畜牧与兽医,2011,44(4):111.

[5]杨志荣,刘世贵,伍铁桥,等.草原毛虫核型多角体病毒的安全性研究Ⅰ.暨草原毛虫核型多角体病毒的致病性研究[J].四川大学学报(自然科学版),1990,36(2):232-238.

[6]刘世贵,任大胜,刘德明,等.草原毛虫核型多角体病毒(Gynaephora ruoergensisGhou et Ying)的发现和鉴定[J].四川大学学报(自然科学版),1984,30(1):107-111,119-122.

[7]刁治民.核型多角体病毒对草原毛虫的毒力测定[J].草业科学,1996,13(3):50-54.

[8]Frid L, Myers JH. Thermal ecology of western tent caterpillarsMalacosoma californicumpluviale and infection by nucleopolyhedrovirus[J]. Ecological Entomology, 2002,27(6):665-673.

[9]杨志荣,伍铁桥,刘世贵,等.V·B草原毛虫生物防治剂的应用技术研究[J].草地学报,1995,3(4):317-323.

[10]刁治民,何长芳.青海草原毛虫核型多角体病毒的初步研究[J].青海畜牧兽医杂志,1993,23(2):3-6.

[11]李海龙,张桂林,党荣理,等.应用SPSS软件进行杀虫剂的KT50分析[J].中国媒介生物学及控制杂志,2011,22(2):155-157.

[12]拉毛才让,王朝华,史小为.阿维菌素与4.5%高效氯氰菊酯防治草原毛虫药效试验报告[J].养殖与饲料,2008,7(5):45-47.

[13]于红妍.2%噻虫啉微囊悬浮剂防治草原毛虫药效的研究[J].黑龙江畜牧兽医,2013,56(9):87-88

[14]于红妍.1.8%阿维菌素和0.5%甲维盐对草原毛虫的防治效果[J].安徽农业科学,2013,41(7):2918-2919.

Amplification of GrNPV and Its Combination with Biological Pesticide

Wang Jin-chang1, Zeng Xiao-qin2, Jin Liang1, Zhan Zhi-gao1
(1.Institute of Microbiology, Jiangxi Academy of Science, Jiangxi Nanchang 330096; 2.Fuzhou Yangzhou Central Primary School, Jiangxi Fuzhou 344000)

In this study, we amplified the GrNPV (GynaephoraruoregensisNuclearPolyhedrosis Virus). Preliminary bioassay tests showed that the median lethal time of Gynaephora aureate Ghou et Ying was about four days, under the treatment of 1×108, 5×107, 1×107, 5×106, 1×106PIB/mLGrNPV to Gynaephora aureate Ghou et Ying. Biological pesticide screening test showed that thiacloprid and abamectin on grassland caterpillar has high mortality, the mortality rates were 97.60% and 88.60% respectively. GrNPV can reduce the abamectin and thiacloprid dosage, and make the high mortality rate of Gynaephora aureate Ghou et Ying. GrNPV and avermectin or thiazoline compound has good insecticidal effect.

Gynaephora aureate Ghou et Ying; GrNPV; Biological control

Q93

A

2096-0387（2017）01-0021-04

国家自然科学基金项目（31260031）；江西省科技重大专项基金项目（2014ACF60002）；江西省科学院产学研项目（2016-YCXY-09）。

王金昌（1975-），男，副研究员，研究方向：生物技术。