基于纳米金/石墨烯修饰电极的免疫传感器检测噻虫啉

姚 军，毛 慧，张 芹，赵国政，张晋华

(1.南京理工大学 环境与生物工程学院，江苏 南京 210094；2.泰州市生态环境局，江苏 泰州 225300；3.江苏省泰州环境监测中心，江苏 泰州 225300；4.南京师范大学 化学与材料科学学院，江苏 南京 210023；5.山西师范大学 磁性分子与磁信息材料教育部重点实验室，山西 临汾 041004)

噻虫啉(Thiacloprid)是在吡虫啉基础上，Bayer公司开发的具有广谱、内吸性新型烟碱类杀虫剂[1，2]。噻虫啉是目前优良的杀虫剂品种之一，其分子结构如图1所示，在我国应用广泛，前景良好[3，4]。近年来，农药管理监督力度不够，农药过度滥用，导致所种植的农作物药害，环境被严重污染，食品中毒事件频发[5-7]。因此，寻找快速准确的噻虫啉检测技术是人们的迫切希望，研究意义重大[8，9]。

图1 噻虫啉的分子结构

目前用于噻虫啉残留检测的方法主要有高效液相色谱法[10]、液相色谱-质谱联机法[11]和固相萃取-高效液相色谱法[12]。但这些检测方法对仪器的操作性要求较高，需要一定的专业技术背景，检测时间较长，难以实现现场检测。以抗原/抗体作为生物识别物质的纳米电化学免疫传感器，具有很好的选择性、较多的种类、较低的测试费用和适合联机化的优点，同时不受样品颜色、浊度的影响，以及所需仪器设备相对简单，具有简便、快速、体积小的优点，已经广泛应用于各个相关领域。目前，石墨烯优异的电化学性能受到广泛关注[13，14]，石墨烯复合物研究引起了新的热潮[15-17]，由纳米金修饰石墨烯的复合材料便是其中之一[18]。Yang等[19]利用纳米金-石墨烯复合材料，检测一种模型农药对氧磷，表现出较高的灵敏度、较低检出限和较好稳定性。Han等[20]利用纳米金-石墨烯复合材料检测癌胚抗原，线性范围0.01～80 ng·mL-1，最低检测限达到3.4 pg·mL-1。

本文建构了纳米金/石墨烯复合纳米材料修饰电极的免疫传感器，基于循环伏安法(Cyclic voltammetry，CV)表征了电极表面的电化学性质，通过间接竞争法实现了体系中噻虫啉的高灵敏检测，并对香蕉、西红柿、苹果和大米实际样品进行了检测。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

CHI852C电化学工作站(上海辰华仪器公司)；噻虫啉(Sigma-Aldrich公司)；壳聚糖(Sigma-Aldrich公司)；噻虫啉抗体(南京晓庄学院生物化工与环境工程学院)；牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA，南京生兴生物技术有限公司)；磷酸缓冲溶液(Phosphate buffer solution，PBS，ThermoFisher公司)。试验用水为二次蒸馏水。

1.2 免疫传感器的制备

噻虫啉溶液的制备:准确称取0.05 g噻虫啉，溶于10 mL N，N-二甲基甲酰胺(N，N-Dimethylformamide，DMF)中，配得0.5 mg·mL-1噻虫啉溶液。蒸馏水对上述标准液稀释，得到0.2 mg·mL-1噻虫啉溶液。

石墨烯分散液的制备:准确称取0.05 g石墨烯[21]，溶于2 mL蒸馏水，超声分散得石墨烯分散液。

玻碳电极(Glassy carbon electrode，GCE)的处理:将电极依次在直径为0.3μm和0.05μm的Al2O3抛光粉上打磨，分别在无水乙醇-蒸馏水、蒸馏水中各超声清洗5 min，蒸馏水冲洗，在2 mM K3Fe(CN)6中扫CV图，以电势差在100 mV以内为标准，衡量电极是否打磨完好。将打磨好的电极放在室温下，晾干。

通过电化学沉积将纳米金修饰在玻碳电极上，再将4μL石墨烯分散液滴涂于电极上，最后将2μL浓度为0.2 mg·mL-1的噻虫啉溶液滴涂于电极表面，40℃烘干。修饰过的电极浸泡在5%的BSA溶液中，37℃烘箱中孵育30 min，以封闭剩余的活性位点。

1.3 香蕉/西红柿/苹果样品的前处理

称取2±0.005 0 g香蕉/西红柿/苹果于10 mL样品管中，加入噻虫啉溶液和3 mL乙腈，超声30 min，离心10 min(2 000 r·m-1)，将上清液转移至样品管，50℃氮气吹干，将1 mL pH=7.4的PBS加入样品管，溶解浓缩物。

1.4 大米样品的前处理

称取1±0.005 0 g大米于10 mL样品管，加入噻虫啉溶液，2 mL蒸馏水浸泡15 min，再加入2 mL乙腈，超声30min，离心10min(2 000 r·m-1)，将上清液转移至样品管，50℃氮气吹干，1 mL pH=7.4的PBS加入样品管，溶解浓缩物。

1.5 电化学检测

工作电极、参比电极与辅助电极分别为纳米金/石墨烯/噻虫啉修饰的玻碳电极、Ag/AgCl电极与铂丝电极，通过CV研究不同修饰电极的电化学行为，运用差分脉冲伏安法(Differential pulse voltammetry，DPV)对杀虫剂噻虫啉进行电化学检测。

2 结果与讨论

2.1 免疫传感器检测噻虫啉的原理

纳米金/石墨烯修饰电极的免疫传感器检测噻虫啉的原理如图2所示。(1)纳米金/石墨烯/噻虫啉电极浸入噻虫啉抗体和游离噻虫啉的孵育液时，固定在电极上的噻虫啉、溶液中游离的噻虫啉分别竞争结合噻虫啉抗体；(2)噻虫啉和噻虫啉抗体之间存在特定的竞争反应，从而使抗体在电极上发生吸附；(3)所形成的抗体-抗原复合物致使电极产生位阻，降低峰值电流。基于电化学信号的差异，实现噻虫啉的定量检测。

2.2 试验条件的优化

孵育时间的优化由DPV确定。首先，用一定体积的抗体依次孵育0、10、15、20、25和30 min。纳米金/石墨烯/噻虫啉电极的DPV峰电流随孵育时间的变化趋势，如图3(a)所示，前25 min电流值快速下降，到25～30 min电流值增加。所以，选择25 min作为免疫反应时间为宜。

图2 纳米金/石墨烯修饰电极的免疫传感器检测噻虫啉的原理

孵育溶液中噻虫啉抗体含量的优化由DPV确定。在不同抗体浓度的50μL溶液中，浸入纳米金/石墨烯/噻虫啉电极，孵育25 min，如图3(b)所示。噻虫啉抗体含量从0μL变化至10μL时，DPV峰值电流明显降低。噻虫啉抗体体积从10μL增至20μL时，峰值电流变化不大，表示电极上的结合位点基本达到饱和。因此，选择10μL作为反应中抗体体积。

图3 孵育时间和抗体含量与DPV峰值电流关系图

2.3 免疫传感器的循环伏安分析

不同阶段修饰电极的CV曲线如图4所示。裸电极a的CV曲线存在一对明显的氧化还原峰。修饰了纳米金/石墨烯/噻虫啉之后的电极b，由于石墨烯优异的电化学活性，CV峰值电流显著增大，电子传递明显增强。放入孵育液之后的电极c，由于特异性免疫反应，电子传递受到阻碍，CV峰值电流下降，表明噻虫啉已修饰到电极上。

图4 不同修饰电极在2 mM K3[Fe(CN)6]PBS溶液中的CV曲线

2.4 噻虫啉的检测

孵育液中游离的噻虫啉、固定在电极表面的噻虫啉竞争分别与溶液中噻虫啉抗体反应，如图5所示，孵育液浓度分别为(a)5 000 ng·mL-1；(b)4 000 ng·mL-1；(c)3 000 ng·mL-1；(d)2 000 ng·mL-1；(e)1 000 ng·mL-1；(f)500 ng·mL-1；(g)100 ng·mL-1；(h)50 ng·mL-1；(i)10 ng·mL-1。从图5可看出，孵育液中，噻虫啉浓度的增加，导致DPV峰值电流逐渐增加。定义在仅含5μL抗体的PBS溶液中，纳米金/石墨烯/噻虫啉电极的响应电流为I0，在含有游离噻虫啉的孵育液中，电极的响应电流为I x，响应电流的差值ΔI与噻虫啉浓度在10～5 000 ng·mL-1范围内成正比，检出限为0.7 ng·mL-1，低于文献中超高效液相色谱法对噻虫啉的残留检测[22]。

图5 不同浓度孵育液中，纳米金/石墨烯/噻虫啉电极的DPV曲线

2.5 重复性与稳定性

对纳米金/石墨烯/噻虫啉修饰电极进行5次DPV扫描，峰值电流的相对标准偏差小于5.5%，表明修饰电极重复性较好。

将纳米金/石墨烯/噻虫啉电极存放在空气中，每隔一天进行DPV扫描，峰值电流的相对标准偏差小于6.5%，表明修饰电极稳定性较好。

2.6 香蕉样品的分析

对3种加入不同量噻虫啉溶液的香蕉样品进行DPV测定，平行测定3次，见表1。如表1所示，噻虫啉的回收率在88.2%～101.1%之间，平均为95.0%。

表1 香蕉样品加标处理检测噻虫啉试验结果

2.7 西红柿样品的分析

对3种加入不同量噻虫啉溶液的西红柿样品进行DPV测定，平行测定3次，见表2。如表2所示，噻虫啉的回收率在95.8%～98.6%之间，平均为97.1%。

表2 西红柿样品加标处理检测噻虫啉试验结果

2.8 苹果样品的分析

对3种加入不同量噻虫啉溶液的苹果样品进行试验前处理并测定，每个浓度测定3次，根据标准曲线，噻虫啉的回收率在87.1%～113.4%之间，平均为102.9%，统计结果见表3。

表3 苹果样品加标处理检测噻虫啉试验结果

2.9 大米样品的分析

对3种加入不同量噻虫啉溶液的大米样品进行DPV测定，平行测定3次，见表4。如表4所示，噻虫啉的回收率在92.8%～103.2%之间，平均为98.5%。

表4 大米样品加标处理检测噻虫啉试验结果

3 结束语

本文构建了一种新型纳米金/石墨烯/噻虫啉电化学免疫传感器检测噻虫啉，结合石墨烯优异的导电性能，以及纳米金优良的导电性能和生物相容性，使纳米金、石墨烯与噻虫啉抗原共同固定于玻碳电极上检测噻虫啉。响应电流的增加ΔI与噻虫啉浓度在10～5 000 ng·mL-1范围内成正比，检出限为0.7 ng·mL-1。这一新型免疫传感器具有较好的重复性、稳定性，将其应用于香蕉、西红柿、苹果与大米等实际样品的检测，取得了满意的结果。