电刺激强化厌氧降解N-甲基吡咯烷酮的研究

应汉超，李 辉，陈 丹，熊姗姗，江心白，李健生，孙秀云，韩卫清，刘晓东，沈锦优

(1.南京理工大学 环境与生物工程学院，江苏 南京 210094；2.安徽红星机电科技股份有限公司，安徽 合肥 231635)

N-甲基吡咯烷酮(N-methylpyrrolidone，NMP)是一种无色透明油状液体，微有胺的气味，属于含氮杂环化合物，分子式为C5H9NO。NMP是一种典型的有机极性溶剂，具有良好的化学稳定性、热稳定性、高极性和低挥发性，能与水或其他许多有机溶剂无限混溶，近年来作为有机化工溶剂应用在各个领域[1]。NMP在化学工业中的广泛应用导致其通过各种途径排放到自然环境中。据估计，每年大约有2 400多吨NMP通过废水排放或转移进入到自然环境中[2]。有研究发现，NMP对人体健康显示出某些毒性，例如它会引起头痛，对呼吸系统和眼睛会产生刺激等[3]。因此，需要尽快找到一种有效的处理方法来解决NMP污染对环境的威胁问题。现有的含NMP废水的处理方法主要分为物理法、化学法和生物法，如表1所示。其中物理法和化学法，比如精馏法[4]、光催化氧化法[5]和芬顿氧化法[6]等，处理NMP废水会消耗大量的化学药品，而且可能会造成二次污染，这些方法在实际应用中常常受到限制。生物法因其耗费少和环境友好性，是一种处理含各种难降解污染物废水的有前途的主流技术[7-9]。其中好氧生物处理法曝气的能源成本较高，并且常产生大量的剩余污泥需要处理处置。由于NMP具有生物毒性，常规的生物处理方法中生物活性受到抑制，导致处理效果不佳[10，11]。传统的厌氧生物处理技术虽然工艺简单、运行费用低、产生的污泥量少，但面临着处理效率低、产物处理不彻底、系统稳定性差等问题。因此，针对含NMP等杂环化合物的废水，开发一种高效、低耗的处理技术，具有重要意义。

表1 各种NMP废水处理方法优缺点对比

近年来，将厌氧生物处理技术与电化学技术相结合的生物电化学技术是废水处理及能源回收领域的研究热点之一。生物电化学系统的阴阳极，往往具有理想的氧化还原电位，使得电化学活性微生物具有高效的电子转移能力。电化学活性微生物是一类能够进行胞外电子传递的微生物，在环境污染物尤其是难降解污染物的生物降解转化过程中起到了重要作用。作为生物电化学系统的一个分支，电刺激厌氧微生物系统(Electricitystimulated anaerobic system，ESAS)是一种以厌氧过程为中心的生物系统，通过调节这一系统的外加电压，以实现污染物的生物强化降解过程。与以产电为主要目标的微生物燃料电池(Microbial fuel cell，MFC)不同，ESAS主要是通过外加电压来调节生物催化的难降解污染物氧化还原过程，其核心是活性微生物与电极之间的相互作用，其中电子通过两种最基本的机制在微生物与电极之间交换，即直接胞外电子转移和介导的胞外电子转移[14-16]。在ESAS中，通过控制外加电压，使具有电化学活性的微生物附着在电极上形成生物膜电极，通过系统中电子的转移过程，实现目标污染物在阴极还原、阳极氧化，从而达到去除污染物的目的。Zhang等[12]采用电刺激微生物系统对含2-氟苯胺的废水进行处理，相比于传统的生物处理，电刺激微生物系统对2-氟苯胺的脱氟速率和矿化速率分别提高了116%和43%。曹占平[13]等采用电刺激微生物系统还原降解五氯酚，降解率可以达到97%。

因此，本研究将包裹石墨毡的钛网电极作为上流式厌氧污泥床反应器的阴阳极，外加电压组成单室电刺激微生物反应器。选取NMP为处理对象，研究电刺激厌氧微生物反应器对NMP的去除可行性，探究影响NMP去除速率的关键因素，推测可能的NMP降解途径。

1 材料与方法

1.1 试验装置

本试验所使用的电刺激微生物系统反应器示意图如图1所示。

图1 电刺激微生物系统反应器示意图

此反应器由内径为12 cm、高度为20 cm的圆柱形亚克力有机玻璃所制，有效体积约为2.3 L。反应器下部为阴极区，上部为阳极区，外层由水浴层包裹，水浴水下进上出。由石墨毡包裹的钛网作为阴阳两个电极，钛网的直径为11.5 cm。在阴阳两极中间设置一个Ag/AgCl参比电极，阴极和阳极用直径为1 mm的钛丝牵出，以测量两极的电位。模拟废水由反应器底部进入，先流经下部的阴极区，再流经上部的阳极区，阴极区和阳极区的间距为2.5 cm。设置一个完全相同的反应器装置(开路)作为厌氧生物对照平行试验，两个反应器同时运行。

1.2 接种污泥与模拟废水

接种污泥采用试验室先期培养的处理含NMP废水的厌氧污泥，初始混合液悬浮固体浓度约为15 g/L。本研究所使用的试验用水为人工配制的NMP模拟废水，模拟废水的组成如下:Na2HPO4·12H2O为1.45 g/L，NaH2PO4·2H2O为0.46 g/L，MgSO4·7H2O为0.2 g/L，CaCl2为0.05 g/L。NMP和乙酸钠浓度根据不同的试验阶段确定。模拟废水在使用前先在120℃的压力蒸汽灭菌锅中灭菌40 min，随后再曝氮气10 min以去除水中的溶解氧。添加乙酸钠主要是为了在NMP的还原过程中提供电子，厌氧微生物可以利用乙酸钠作为生长所需碳源，代谢产生的电子通过胞外电子传递实现NMP的还原。外加电压根据各参考文献中记录的电刺激微生物系统的外加电压，综合考虑外加电压从0开始以0.1 V的增量增加。进水NMP根据实际生产排放废水中可能达到的浓度进行设置。

1.3 分析方法

混合液悬浮物(Mixed liquor suspended solids，MLSS)根据标准方法进行测定。NMP的浓度通过高效液相色谱法(High performance liquid chromatography，HPLC)进行鉴定和定量，HPLC条件:水样经0.22μm滤头过滤，10μL过滤液注入HPLC。使用C18柱在30℃柱温和214 nm紫外-可见波长下进行HPLC分析，流动相为20%甲醇和80%超纯水(v/v)，以1.0 mL·min-1的流速泵送。总有机碳(Total organic carbon，TOC)在TOC分析仪上测量。采用液相色谱-质谱联用(High performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS)对NMP降解的中间产物进行鉴定，HPLC-MS条件:正离子检测；离子源喷射电压:5 kV；毛细管温度:320℃；毛细管电压:15 V；鞘气:氮气；鞘气流速:45 arb、辅助气流速:15 arb；碰撞气:氦气；液相色谱仪进样，溶液流速0.2 mL·min-1。采用16S rRNA Ilumina基因测序方法对微生物群落结构进行分析。

2 结果与讨论

2.1 不同体系下NMP降解效果对比

试验对比了电化学系统、厌氧生物系统以及电刺激微生物系统3种体系对NMP的降解，去除效果比较如图2所示。电化学系统试验条件:外加电压0.4 V，进水NMP负荷10.10 mol·m-3·d-1，乙酸钠浓度800 mg/L，不添加活性污泥；厌氧生物系统试验条件:进水NMP负荷10.10 mol·m-3·d-1，乙酸钠浓度800 mg/L，无外加电压；电刺激微生物系统试验条件:外加电压0.4 V，进水NMP负荷10.10 mol·m-3·d-1，乙酸钠浓度800 mg/L。

图2 不同体系下进出水负荷以及NMP去除效果对比

电刺激微生物系统对NMP的去除率(约80%)比单纯的电化学系统(约13%)和厌氧生物系统(约55%)都要好，并且比电化学系统和厌氧生物系统两者去除率之和还要高约12%，说明电刺激和微生物在对NMP的降解过程中存在协同作用，大大地增强了NMP的去除效果。在电刺激微生物系统中，微生物的降解起到主导作用，外加电压起到辅助的作用，促进微生物对NMP的降解。微生物降解NMP时，NMP还原降解所需要的电子主要来自于微生物代谢乙酸钠，有限的电子供体外加量和微生物的活性限制了NMP的还原速率。当提供电刺激后，电辅助阴极在较低的电位下可以提供更多NMP还原所需电子的同时，可能促进了某些功能微生物的生长和活性，从而实现NMP的强化降解。在电化学系统中，较低的电压不能达到较好的去除效果，若提供较高的电压，又会消耗大量的能源，造成高额的处理成本，不利于实际生产中的应用。因此，综合各方面条件来说，电刺激微生物系统不仅对NMP有着不错的去除效果，而且还降低了污染废水的处理成本，为NMP的处理提供了一条新思路。

2.2 关键因素对系统去除NMP效果的影响

2.2.1 外加电压

在这一阶段试验中，进水NMP负荷为10.10 mol·m-3·d-1，乙酸钠浓度为800 mg/L，外加电压分别为0 V、0.1 V、0.2 V、0.3 V、0.4 V，比较外加电压对厌氧生物系统和电刺激微生物系统NMP去除效果的影响。

图3 外加电压对系统的影响

如图3(a)所示，随着外加电压从0 V到0.4 V逐步增加，NMP的去除率也逐渐增加，在外加电压为0.4 V时，NMP的去除率接近80%。外加电压增加后，阳极电位基本维持不变，阴极电位则逐步降低，这也能说明在外加电压后，生物阴极具有更强的还原能力，提升了NMP的去除效果。在更负的阴极电位下，可以形成阴极的还原性微环境和阳极的氧化性微环境，对NMP的降解更加有利。外加电压是加速污染物快速降解的重要条件，为电刺激微生物系统提供了还原所必需的电子。提高外加电压加速了电子传递效应，促进了反应的进行，加快了污染物的降解。在厌氧生物系统中，NMP去除率有少许的提高，这可能是因为厌氧生物系统的启动时间比较长，在此过程中微生物逐渐适应环境，提升了去除效果。图3(b)中，随着外加电压的增加TOC去除率有所提升。TOC去除率的提高说明了外加电压的增大加强了NMP的降解矿化。

由这一阶段试验数据得，在外加电压为0～0.4 V的范围内，当电压为0.4 V时，电刺激微生物系统对NMP的去除率最高。0.4 V的外加电压相对较低，在试验中电量的消耗较低，这对于电刺激微生物系统的推广应用至关重要。为了探讨电刺激厌氧微生物系统降解NMP的可行性及其涉及的内在机理，后续试验将外加电压控制在0.4 V，以进一步探究其他参数对NMP降解过程的影响。

2.2.2 进水NMP负荷

此阶段试验在外加电压为0.4 V，乙酸钠浓度为800 mg/L的条件下进行，在进水NMP负荷分别为6.06 mol·m-3·d-1、8.08 mol·m-3·d-1、10.10 mol·m-3·d-1、12.12 mol·m-3·d-1的条件下比较NMP的去除效果以及TOC去除率的变化，结果如图4所示。图4中，fin表示进水负荷。

图4 进水NMP负荷对系统的影响

当进水NMP负荷为6.06 mol·m-3·d-1时，电刺激微生物系统和厌氧生物系统中的去除效果较好，分别达到约93%和82%，随着进水NMP负荷的增加，两个系统对NMP的去除效果都有所下降。当进水NMP负荷提升至12.12 mol·m-3·d-1时，两个系统中NMP的去除率分别约为64%和42%。由于厌氧生物系统的稳定性较差，容易受到外界因素的干扰，所以厌氧生物系统的去除效果下降更加明显，同时说明电刺激微生物系统具有更强的耐冲击负荷能力，稳定性更强。阴阳两极的电位随着进水NMP负荷的提升都有了一定的升高，说明系统的氧化还原能力有所下降。进水NMP负荷的增加，导致两个系统中NMP的去除率下降，所以TOC去除率也都呈现出下降的趋势。

2.2.3 电子供体用量

这个阶段试验在外加电压为0.4 V，进水NMP负荷为10.10 mol·m-3·d-1的条件下进行，在乙酸钠浓度分别为400 mg/L、600 mg/L、800 mg/L的条件下运行反应器，观察NMP降解效果以及TOC去除率的变化，结果如图5(a)、(b)所示。图5中，CH3COONa表示乙酸纳浓度。

图5 乙酸纳浓度对系统的影响

当乙酸钠的浓度为400 mg/L时，电刺激微生物系统和厌氧生物系统中NMP的去除率都比较低，分别约为59%和32%，随着浓度上升到800 mg/L，两个系统对NMP的去除效果都有提升，分别约为78%和55%，这可能是由于乙酸钠作为电子供体，在加入乙酸钠的浓度提升后，能够提供更多的电子用于污染物的还原。乙酸钠浓度的提升对厌氧生物系统的NMP去除效果有着更显著的增强，说明厌氧生物系统还原降解NMP的过程中对乙酸钠的依赖性更强。在电刺激微生物系统中，NMP一部分通过厌氧微生物代谢乙酸钠提供的电子来降解，还有一部分是通过微生物用电极提供的电子来降解，所以此系统相比厌氧生物系统，对乙酸钠浓度的变化具有更好的适应性，更强的稳定性。同时，TOC去除率呈上升趋势，这也从侧面验证了NMP的去除率随着乙酸钠浓度的提升而升高。

图5(c)显示的是乙酸钠用量比(去除每摩尔NMP使用的乙酸盐摩尔数)。乙酸钠的用量比与系统运营的成本有着直接关系。随着乙酸钠浓度从400 mg/L提升到800 mg/L，在电刺激微生物组中，乙酸钠的添加量与NMP去除摩尔比从0.81上升到1.23，而厌氧生物组的乙酸钠添加量与NMP去除摩尔比则从1.52上升到1.74，可以看出在不同乙酸钠浓度下，电刺激微生物组的乙酸钠用量比都明显小于厌氧生物组，表明电刺激微生物系统对电子供体的需求量较低。此外，降低乙酸钠的用量可以很好地补偿电刺激微生物系统中由于加电而产生的额外成本。

2.3 NMP降解产物分析及降解途径推测

对电刺激微生物系统的出水先经过预处理，然后进行液相色谱-质谱分析，得到如图6(a)～(e)所示的液质分析图。在2.76～2.85 min时出现的99.85的峰为污染物NMP的峰，对其余谱图计算分析后，猜测其中含有的物质分别为琥珀酸半醛、琥珀酸、1-甲基吡咯烷-2-醇和N-甲基-4-氨基丁酸。

根据液质分析得到的中间产物推测出NMP可能的降解途径如图6(f)所示。NMP首先在阴极区域被还原为1-甲基吡咯烷-2-醇，之后这一产物进入阳极区域开环并被氧化为N-甲基-4-氨基丁酸，然后N-甲基-4-氨基丁酸进行下一步的脱氮过程，一部分通过氨化作用转化产生氨氮，另一部分则被氧化为琥珀酸半醛、琥珀酸，最终被降解矿化，生成氢气和二氧化碳。

图6 NMP降解产物分析及降解途径推测

2.4 微生物群落动态变化分析

分别对接种污泥(Inoc)、厌氧对照组污泥(Rc)和电刺激试验组污泥(Re)进行采样收集，采用16S rRNA Ilumina基因测序方法对微生物群落结构进行分析。如图7为3个样品在细菌属水平下的优势菌种相对丰度。

在Inoc样品中占优势的菌属主要是Bacteroidetes(10.04%)和Proteiniclasticum(8.96%)，Rc样品与之相似，相对丰度分别为11.58%和14.42%。在Re样品中，优势菌属主要是Rhizobium(19.02%)、Bacteroidetes(6.88%)和Pseudomonas(8.86%)。有研究报道，Rhizobium和Pseudomonas具有降解含氮杂环化合物的功能[17，18]。同时，Rhizobium是已知的能够产生胞外聚合物的菌种[19]。Pseudomonas广泛存在于环境中，是已知的常见电化学活性菌，能够利用各种电子供体进行氮转化[20]。另外有研究报道，Proteiniclasticum具有水解酸化的功能[21]，Bacteroidetes具有发酵的功能[22]。电刺激促进了功能微生物的生长和活性。

图7 各样品在细菌属水平下的优势菌种相对丰度

3 结束语

针对传统厌氧生物降解效率低下的问题，本文提出了一种电刺激厌氧微生物系统，强化了NMP的厌氧生物降解。在电刺激厌氧微生物系统中，微生物和电场之间存在着协同作用。电刺激提高了厌氧生物系统的稳定性，大大降低了电子供体需求量，促进了NMP的去除。在外加电压为0.4 V，进水负荷为6.06 mol·m-3·d-1，乙酸钠为800 mg/L的优化条件下，电刺激微生物系统对NMP的去除率可达到93%，TOC去除率接近90%。最后结合鉴定出的中间产物提出了在电刺激微生物系统中促进NMP厌氧生物降解的可能代谢机制。本研究为开发高效、经济的有机污染物厌氧生物强化降解方法提供了新的思路。