蛋清溶菌酶的分离纯化及其抑菌活性研究

张黎丽，马梦琳，李晨熙，常允康

（济宁医学院，山东日照276800）

蛋清溶菌酶的分离纯化及其抑菌活性研究

张黎丽，马梦琳，李晨熙，常允康*

（济宁医学院，山东日照276800）

本文以新鲜鸡蛋为原材料，从中高效地提取溶菌酶并对其抑菌性能进行研究。采用等电点沉淀、热沉淀和阳离子交换的方法对溶菌酶进行分离纯化，经SDS-PAGE检测，纯度达到80%以上。通过抑菌圈法检测溶菌酶对白色念珠菌、表皮葡萄球菌、球状芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、大肠杆菌、变形杆菌和铜绿假单胞菌的抑菌活性。结果显示，白色念珠菌的抑菌圈直径为18.35mm，其余6种菌的抑菌圈直径均小于7mm。由此可见，该溶菌酶仅对白色念珠菌有抑菌作用，对其他6种菌无明显的抑菌作用。虽然溶菌酶抑菌谱并不是很广泛，但仍有较高的研究价值。

溶菌酶；蛋清；等电点沉淀；阳离子交换；抑菌圈

溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，能选择性地催化某些细菌的细胞壁多糖的水解，因而具有杀菌、抗病毒、抗肿瘤细胞等功效。其广泛存在于鸟、家禽的蛋清，哺乳动物的泪液、唾液、血浆和组织细胞中[1]，其中以鸡蛋的蛋清中含量最为丰富，约为2‰。目前，以动物的内脏和霉菌为原料生产溶菌酶，在国外已经开始工业化生产。但我国现在生产规模较小，还需要进口。近几年来，国内以鸡蛋清和鸡蛋壳为原料提取溶菌酶已经开始有小规模的生产。溶菌酶在医药、化工、食品和发酵工业等领域已得到广泛应用。目前，多数商品溶菌酶是从蛋清中提取出来的[2-4]，但由于蛋清中杂蛋白的含量很高，使得在制取高纯度溶菌酶的过程中操作比较复杂，成本也相对较高。目前，溶菌酶分离纯化的方法主要包括直接提取法、结晶法、膜色谱、沉淀法、离子交换法、反胶团萃取、电泳法、双水相萃取和亲和沉淀等[5]。本文拟通过等电点沉淀、热沉淀和阳离子交换法对蛋清中溶菌酶进行分离纯化，并通过抑菌圈法研究其抑菌活性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

白色念珠菌、表葡萄球菌、球状芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、大肠埃希氏菌、变形杆菌和铜绿假单胞菌，实验室保藏菌种；鲜鸡蛋，市售；磷酸氢二钠、氯化钠、酵母粉、蛋白胨等试剂，均为国药集团化学试剂有限公司；sp阳离子交换树脂，GE；10kD超滤管，密理博。

1.2 试验方法

1.2.1 粗酶液的制备

将鸡蛋外壳洗净，擦干蛋壳外部水分，轻轻地将鸡蛋外壳敲破，保证在鸡蛋蛋黄部分完好无损的状态下，收集蛋清液，pH值应为8.1左右（25℃），再用2层纱布过滤掉蛋清中的脐带块和碎蛋壳，最后加入2倍体积的pH7.5磷酸盐缓冲液。

采用等电点沉淀法，向蛋清溶液中逐滴滴加1 mol/L HCl，调节粗酶液的pH值至4.5，7 000rpm离心15min，取上清。

根据热沉淀方法，将上清液于70℃水浴锅中加热15min，7 000rpm离心20min，取上清，并再次通过等电点沉淀法，用1mol/L NaOH调节pH值至6.5，再次以7 000rpm离心20min，取上清液，即为粗酶液。

1.2.2 阳离子交换法纯化溶菌酶

①试验前处理，用蒸馏水以一定流速平衡阳离子交换柱至基线稳定；②柱平衡，调节系统压力，确定流速为2.5mL/min，用20mM pH6.5的磷酸盐缓冲液平衡阳离子交换柱至基线稳定，基线归0；③上样，将得到的粗酶液以1mL/min的流速上样于阳离子交换柱；④平衡，用20mM pH6.5的磷酸盐缓冲液再次平衡阳离子交换柱至基线稳定；⑤洗脱并收集，用0.5%～5.0%硫酸铵溶液进行分步洗脱，收集洗脱液，每管1mL，当洗脱液中无明显蛋白质时停止洗脱，选择蛋白峰较高的几管合并，使用截留分子量12kD以下的超滤管，用20mM pH6.5的磷酸盐缓冲液，4 500rpm离心洗涤多次，进行脱盐和浓缩。

1.2.3 溶菌酶纯度检测

采用SDS-PAGE对溶菌酶进行检测，浓缩胶和分离胶采用的浓度和电压分别为3%、80V和12%、120V，考马斯亮兰染色。

1.2.4 溶菌酶的含量测定

将商品溶菌酶用20mM pH6.5的磷酸盐缓冲液稀释成不同梯度浓度（0.0、0.2、0.4、0.8mg/mL和1.6mg/mL），以溶菌酶浓度为横坐标，281nm波长吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，并求出回归方程。

纯化所得的溶菌酶用20mM pH6.5的磷酸盐缓冲液稀释，281nm波长吸光度测定其吸光度，用上述标准曲线回归方程计算制备的溶菌酶含量。

1.2.5 溶菌酶的抑菌试验

试验所用7种菌（白色念珠菌、表葡萄球菌、球状芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、大肠埃希氏菌、变形杆菌和铜绿假单胞菌），划线于固体LB平板，35℃培养16h左右，挑取单菌落接种于液体LB培养基中，35℃ 200rpm培养12h左右，得到活化后菌液。

用打孔器制作出直径50mm的滤纸片，121℃高压灭菌20min，烘干。将滤纸片浸泡于所得的溶菌酶液中，即得药敏纸片。

在超净工作台中进行以下无菌操作：用移液枪分别吸取7种活化好的菌液50μL，涂布于LB平板上，待培养基充分吸收菌液后，用无菌的镊子将药敏纸片贴在涂好菌液的平板上，35℃培养16h，游标卡尺测量其抑菌圈直径。

2 结果与分析

2.1 溶菌酶的分离纯化

对等电点沉淀、热沉淀、离子交换前后的溶菌酶留样，用于后续的SDS-PAGE检测。其中，阳离子交换层析采用0.5%、1.7%、5.0%的硫酸铵溶液进行分步洗脱。层析条件如下，流速为2.5mL/min，1min收集1管，结果见图1。

图1 阳离子交换层析图谱

如图1所示，峰1为上样时的穿透峰，其成分主要是杂蛋白；峰2为0.5%硫酸铵溶液的洗脱峰，该峰中的主要成分是带少量正电荷的杂蛋白；峰3为1.7%硫酸铵溶液的洗脱峰，此峰为目的蛋白峰。经纯度检测后，选取纯度较高的几管进行合并。

使用10kD的超滤管，通过多次离心洗涤，对纯酶液进行脱盐和浓缩，最终将酶液浓缩至4mL。

2.2 SDS-PAGE检测溶菌酶纯度

对纯化步骤前后留样的溶菌酶酶液进行SDSPAGE检测，结果见图2。

图2 各纯化步骤前后溶菌酶酶液的SDS-PAGE分析

从图2可以看出，4、6、7号泳道经等电点和热沉淀步骤后，明显较1号泳道的杂蛋白含量降低。通过5号和7号泳道，发现在等电点沉淀和热沉淀过程中，溶菌酶亦有损失。8号泳道穿透液中全部为杂蛋白，溶菌酶在该阳离子交换柱中被吸附的效果较好，且未到其最大吸附容量。9号泳道为0.5%的硫酸铵溶液洗脱下来的蛋白条带，该蛋白可能是非特异性吸附或是表面可能带有少量正电荷从而被吸附，经较低浓度的硫酸铵即可洗脱下来。10～12号泳道为1.7%硫酸铵溶液洗脱下来的条带，11、12泳道中，溶菌酶含量可达80%以上，纯度较高。

2.3 溶菌酶的含量测定

根据标准曲线，计算得所提取的溶菌酶含量为5.4mg/mL（见图3）。

图3 商品溶菌酶含量标准曲线

2.4 溶菌酶的抑菌试验

采用抑菌圈法，考察纯化所得的溶菌酶对白色念珠菌、表葡萄球菌、球状芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、大肠埃希氏菌、变形杆菌和铜绿假单胞菌7种菌的抑菌效果，结果见表1。

表1 蛋清溶菌酶对不同菌种的抑菌效果

根据《消毒技术规范》，抑菌圈直径大于7mm，可判定为有抑菌效果。由此可以看出，所提取溶菌酶仅对白色念珠菌有抑菌作用，对3种革兰氏阳性菌和3种革兰氏阴性菌无明显的抑菌作用。这可能是因为不同细菌细胞壁结构上的差异[6]，这种差异不仅是肽聚糖和非肽聚糖的比例，而且肽聚糖层的结构组成也很大程度上影响着细菌对于溶菌酶的敏感性。

3 结论

本文通过等电点沉淀、热沉淀、阳离子交换3步纯化方法，高效率地从鸡蛋清中纯化出了溶菌酶，而且所得溶菌酶纯度可达80%以上，具有非常好的应用前景。对其进行抑菌试验发现，所提取溶菌酶仅对白色念珠菌有抑菌作用，而对其他几种普通革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌无明显的抑菌作用。虽然鸡蛋清来源的溶菌酶抑菌谱不够广泛，但是针对性地开发某一种抗菌消炎药物或者与其他成分联合使用，仍能获得良好效果。如今，抗生素的滥用已经造成了严重后果，而溶菌酶绿色、安全、不会带来抗药性后果的特点，也使其成为研究的热点。

[1]戴清源.溶菌酶的研究进展[J].山东食品发酵,2005,35(3):23-25.

[2]刘慧,王凤山,楚杰.蛋清溶菌酶部分酶学性质及酶活性的影响因素研究[J].中国生化药物杂志,2008,29(6):385-391.

[3]常凯,邸海洋,何昭阳.溶菌酶的提取及其在焙烤食品中的应用[J].食品科技,2008,33(10):167-169.

[4]石军英,郭雄军,陈劲春.鸡蛋溶菌酶生产过程活力动态监控[J].食品科技,2008,33(11):10-13.

[5]凤权,汤斌.溶菌酶分离纯化方法的研究进展[J].生物学杂志,2006,23(1):5-7.

[6]曹涛,刘同军,王艳君.微生物溶菌酶的研究及应用[J].中国调味品,2011,36(3):23-26.

Isolation, Purification and Antibacterial Activity of Lysozyme from Egg White

Zhang Li-li, Ma Meng-lin, Li Chen-xi, Chang Yun-kang*
(Jining Medical University, Shandong Rizhao 276800)

In this paper, fresh egg was used as raw material to extract lysozyme efficiently and study its antibacterial activity. The lysozyme was isolated and purified by isoelectric precipitation, thermal precipitation and cation exchange. The purity was above 80% by SDS-PAGE. The antibacterial activity of lysozyme against Candida albicans, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Bacillus cereus, Escherichia coli, Bacillus proteus and Pseudomonas aeruginosa was detected by the method of bacteriostasis circle. The results showed that the bacteriostatic circle diameter of Candida albicans was 18.35 mm, and the diameter of the other six strains were less than 7 mm. It can be seen that the lysozyme has antibacterial effect on Candida albicans, and has no obvious inhibitory effect on the other six kinds of bacteria. Although the antibacterial spectrum of lysozyme is not very extensive, it still has high research value.

Lysozyme; Egg white; Isoelectric precipitation; Cation exchange; Bacteriostatic ring

TQ464.8

A

2096-0387（2017）01-0013-04

济宁医学院青年基金项目（JYQ14KJ14）。

张黎丽（1987-），女，山东淄博人，硕士，助理实验师，研究方向：生物资源与环境。

常允康（1987-）,男，山东荣成人，硕士，讲师，研究方向：生物资源与环境。