漆树木粉抗氧化活性成分的HPLC-MS分析

陈虹霞， 王成章,2*， 周 昊，2， 陶 冉， 叶建中

(1.中国林业科学研究院 林产化学工业研究所；生物质化学利用国家工程实验室；国家林业局 林产化学工程重点开放性实验室；江苏省 生物质能源与材料重点实验室， 江苏 南京 210042；2.中国林业科学研究院 林业新技术研究所， 北京 100091)

漆树木粉抗氧化活性成分的HPLC-MS分析

CHEN Hongxia

陈虹霞1， 王成章1,2*， 周 昊1，2， 陶 冉1， 叶建中1

(1.中国林业科学研究院 林产化学工业研究所；生物质化学利用国家工程实验室；国家林业局 林产化学工程重点开放性实验室；江苏省 生物质能源与材料重点实验室， 江苏 南京 210042；2.中国林业科学研究院 林业新技术研究所， 北京 100091)

采用有机溶剂对漆树木粉醇提物进行逐级萃取分离，得到石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相，通过比较4个萃取相对DPPH自由基(DPPH·)、ABTS自由基(ABTS·)和羟基自由基(OH·)的清除能力，探讨了萃取相的抗氧化活性。结果表明：乙酸乙酯相的萃取得率最高，为60.1%；对DPPH·、ABTS·和OH·均具有最强的清除作用，其半数抑制质量浓度(IC50)值分别为19.9、 29.74和37.95 mg/L。通过HPLC-MS裂解规律分析，从乙酸乙酯相中鉴定出酚酸类和黄酮类2类化合物，其中酚酸类化合物为：对乙氧基-3-羟基苯甲酸(1)、没食子酸(2)、 3,4-二羟基杏仁酸(3)、没食子酸十六烷酯(4)、原儿茶酸(5)和没食子酸乙酯(7)；黄酮类化合物为：黄颜木素(6)、 3,4′,7-三羟基二氢黄酮醇(9)、漆黄素(13)、硫黄菊素(14)、紫铆花素(15)和3,7-二羟基黄酮醇- 4′-鼠李糖苷(16)。

漆树；木粉；抗氧化；活性成分；液质联用

漆树为漆树科漆树属的一种落叶乔木[1]。漆树不同部位都具有多种用途，富含生物碱、糖类、萜类、黄酮、单宁、漆酚和漆酶等生物活性物质，历史上一直将其作为传统的中草药用于胃肠炎、心脏病、关节炎、高血压、糖尿病、中风以及慢性疲劳等疾病的治疗[2]。近年来的研究表明，漆树木粉醇提取物(醇提物)具有显著的抗氧化、抗肿瘤及抗炎作用[3-5]。漆树木粉醇提物具有多种不同极性的化合物，包括脂溶性、醇溶性以及水溶性成分。溶剂逐级萃取法是天然产物分离和纯化最常规的方法，广泛应用于不同极性植物提取物的初步分离。Kim等[5]采用正己烷、乙酸乙酯、正丁醇进行逐级萃取漆树醇提物，并从乙酸乙酯萃取物中分离得到多个黄酮类化合物。HPLC-MS技术具有高效分离、高灵敏度、高选择性及快速分析等特点，被认为是20世纪后期最重要的分析手段之一，广泛应用于药物的分析与检测[6-8]。鉴于漆树醇提物特殊的药理活性，因此有必要从化学组成及结构等方面对其进行详细研究。本研究采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水对漆树木粉醇提物进行逐级萃取分离，对各萃取组分进行了体外清除DPPH自由基、ABTS自由基和羟基自由基的能力测定，进一步采用HPLC-MS鉴定乙酸乙酯相中的抗氧化活性成分，为有效开发和利用漆树木粉中的活性物质提供实验依据。

1 实 验

1.1 原料、试剂与仪器

漆树木粉：漆树木材2013年8月收集于湖北恩施，树龄10年，切片自然晾干，粉碎后备用。甲醇、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、硫酸亚铁、邻菲罗啉、氢氧化钠、磷酸二氢钾、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、30%的双氧水、铁氰化钾、三氯乙酸和三氯化铁，均为分析纯；2,2′-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑啉- 6-磺酸)二胺盐(ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，购自Sigma公司。1200 Series 6310 lon Trap型高效液相色谱-质谱仪，Agilent Technologies公司；MULTISKAN GO型酶标仪，Thermo fisher scientific公司。

1.2 实验方法

1.2.1 提取与分离 取漆树木材粉末2 kg，按液料比20 ∶1(mL ∶g，下同)，加入质量分数为70%的乙醇水溶液，采用减压回流提取2次，每次1 h，过滤，合并滤液，于40 ℃下减压蒸发除去溶剂，即得乙醇粗提物。粗提物按液料比5 ∶1～10 ∶1加入蒸馏水，搅拌溶解，加入石油醚萃取3次，分离，在40～60 ℃下减压蒸发除去溶剂，干燥得到石油醚相；水层继续用乙酸乙酯萃取3次，分离，在40～60 ℃下减压蒸发除去溶剂，干燥得到乙酸乙酯相；水层继续用正丁醇萃取3次，分离，在40～60 ℃下减压蒸发除去溶剂，干燥得到正丁醇相和水相。

1.2.2 高效液相色谱-质谱分析 色谱柱为C18Gold AQ反相柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇(A)，0.5%醋酸水溶液(B)。梯度洗脱：0～20 min 70%B，20～35 min 30%B，35～50 min 10%B，50～55 min 70%B。紫外检测器，波长280 nm，流速为0.5 mL/min，进样量10 μL。电离方式：电喷雾(ESI)负离子模式，干燥器流速12.00 L/min，干燥器温度325 ℃，雾化器压力241.325 kPa，分子质量扫描范围100～1 000 u。

1.2.3 对DPPH自由基清除能力的测定 取0.15 mmol/L的DPPH乙醇溶液150 μL，加入50 μL不同浓度的样品溶液，混合均匀后在黑暗处室温下反应30 min后，在517 nm波长下测吸光度，每个样品平行3次，取平均值[9]。样品液对DPPH自由基(DPPH·)清除率(yDPPH·)计算公式见式(1)：

(1)

式中：Ai—待测样品与DPPH在乙醇溶剂中的吸光值；A0—待测样品在乙醇溶剂中的吸光值；A1—DPPH乙醇溶液的吸光值。

1.2.4 对ABTS自由基清除能力的测定 储备液的制备[10]：将7.4 mmol/L的ABTS溶液与2.6 mmol/L的过硫酸钾溶液等量混合，在黑暗处常温静置反应15 h，然后取1 mL溶液用甲醇稀释，得到溶液在734 nm处的吸光度为0.74。加入150 μL的上述储备液配制不同浓度的样品溶液50 μL，在96孔板中，放置4 min后，在734 nm波长下测吸光度，每个样品平行3次，取平均值。样品液对ABTS自由基(ABTS·)清除率(yABTS·)计算见式(2)：

(2)

1.2.5 对羟基自由基清除能力的测定 将不同溶剂萃取物配制成不同浓度的样品溶液。在10 mL的试管中依次加入60 μL的5 mmol/L邻菲罗啉， 40 μL的pH值7.4的磷酸缓冲溶液， 60 μL的5 mmol/L硫酸亚铁， 60 μL的15 mmol/L的EDTA， 60 μL的蒸馏水，100 μL的样品溶液和80 μL的0.1%H2O2,摇匀，37 ℃水浴加热60 min后取出，于536 nm处测其吸光度[11]。对羟基自由基(OH·)清除率(yOH·)的计算见式(3)：

(3)

式中：A″i—加样品的吸光值；A″0—不加样品的吸光值；A″1—不加样品和H2O2的吸光值。

1.2.6 统计分析 采用origin 7.5软件进行绘图及计算。

2 结果与讨论

2.1 不同溶剂萃取相的抗氧化能力

由表1可知，通过不同有机溶剂萃取，乙酸乙酯相的萃取得率最高，其次是水相，正丁醇相的萃取得率最低。各萃取相对3种自基由的清除效果由强到弱依次为：乙酸乙酯相>正丁醇相>石油醚相>水相，其中乙酸乙酯相对DPPH·、 ABTS·和OH·的半数抑制质量浓度(IC50)值分别为19.9、 29.74和37.95 mg/L。说明漆树木粉乙酸乙酯相是具有抗氧化活性成分的主要部位，因此采用HPLC-MS对乙酸乙酯相进行化学成分的鉴定。

表1 不同溶剂萃取相的抗氧化能力Table 1 Antioxidant capacity of different fractions of wood powder

2.2 HPLC-MS鉴定漆树木粉乙酸乙酯相中的化合物

图1 乙酸乙酯相的HPLC-MS总离子流图Fig.1 TIC of HPLC-MS of ethyl acetate fraction

漆树木粉乙酸乙酯相经过0.45 μm微孔滤膜过滤后进入HPLC-MS进行分离检测，总离子流图如图1所示。选用G18 Gold AQ极性封端C18色谱柱，采用不同比例的甲醇和含0.5%的醋酸水溶液作为流动相，在该条件下乙酸乙酯相的化合物得到很好的分离和保留。根据图1中主要色谱峰的保留时间，以及一级质谱和二级质谱的特征离子峰、分子质量，结合参考文献[12-20]推测化合物如表2所示。从乙酸乙酯相中初步表征得到12种化合物，其中6种为酚酸类化合物，另外6种为黄酮类化合物。此外，还有4种化合物无法辨别。

在负离子模式下，化合物1的[M-H]-峰为m/z181，推断它的分子式可能为C9H10O4，其二级质谱碎片离子m/z136和108通过丢失OCH2CH3(M-H-45u)和CO(M-H-45u-28u)获得，与文献[12]进行比对，推测该化合物为对乙氧基-3-羟基苯甲酸。

化合物2的[M-H]-峰为m/z169，推断它的分子式可能为C7H6O5，其二级质谱碎片离子为m/z125通过丢失CO2(M-H-44u)获得，该化合物的相关信息与文献[13]相比对，判定该化合物为没食子酸。

化合物3的[M-H]-峰为m/z183，推断它的分子式可能为C8H8O5，其二级质谱主要的碎片离子为m/z167和m/z123通过丢失O(M-H-16u)和CO2(M-H-16u- 44u)获得，该化合物的相关信息与文献[14]相比对，推断该化合物可能为3,4-二羟基杏仁酸。

表2 乙酸乙酯相的HPLC-MS定性分析结果Table 2 Analysis of ethyl acetate fraction by HPLC-MS

化合物4的[M-H]-峰为m/z393，推测可能的分子式为C23H38O5。其二级质谱主要碎片离子m/z316、 241、169和125通过丢失C7H4O4(M-H-152u)、C16H33(M-H-224u)和CO2(M-H-224u-44u)获得。其中主要的碎片离子与没食子酸相似，而其中m/z241的碎片离子可能为长链烷醇，该化合物的相关信息与文献[15]相比对，推断该化合物为没食子酸十六烷酯。

化合物5的[M-H]-峰为m/z153，推测可能的分子式为C7H6O4。二级质谱主要碎片离子m/z109由丢失CO2(M-H-44u)获得，碎片特征与文献报道[8]相近，故推断该化合物为原儿茶酸，即3,4-二羟基苯甲酸。

化合物6的[M-H]-离子峰为m/z287，推测可能的分子式为C15H12O6。二级质谱主要碎片离子m/z269、197和153由丢失H2O(M-H-18u)、C6H2O(M-H-90u)和C7H2O4(M-H-134u)获得。脱水可能是3位上的羟基进行脱水反应，碎片离子m/z197和丢失碎片m/z90可能是黄酮发生逆Dields-Alder(RDA)裂解，C环0位和4位发生断裂产生的碎片离子，碎片离子m/z153和丢失的碎片m/z134可能是C环1位和3位发生的RDA裂解，这些数据与文献报道[16]的数据相似，故推测该化合物为黄颜木素。

化合物7的[M-H]-离子峰为m/z197，推测该化合物的分子式为C9H10O5。二级质谱主要碎片离子m/z169和125由丢失C2H4(M-H-28u)和CO2(M-H-28u-44u)获得。该化合物中的主要碎片离子与没食子酸相似，而m/z169的碎片离子是由丢失C2H4(28u)中性分子获得。这些碎片特征与文献报道[17]相近，推断该化合物为没食子酸乙酯。

化合物9的[M-H]-离子峰为m/z271，推测该化合物的分子式可能为C15H12O5。二级质谱主要碎片离子m/z243、227和179由丢失CO(M-H-28u)、CO2(M-H-44u)和C6H4O(M-H-92u)获得。CO和CO2为C环4位上的脱羰基引起的，而碎片离子m/z179和丢失的碎片m/z92 可能是脱去B环而发生的裂解，将这些信息与文献[18]进行比对，推测该化合物可能为3,4′,7-三羟基二氢黄酮醇。

化合物13的[M-H]-离子峰为m/z285，推测该化合物的分子式为C15H10O6。二级质谱主要碎片离子m/z257、163和135由丢失CO(M-H-28u)、C7H6O2(M-H-122u)和C8H6O3(M-H-150u)获得。CO可能是C环上4位的脱羰基引起的，碎片离子m/z135和丢失碎片m/z150可能是黄酮发生RDA裂解，由C环1位和3位断裂产生的碎片离子，碎片离子m/z163和丢失碎片m/z122，可能是C环1位和2位发生的RDA裂解，将这些信息与文献[18]进行比对，推断该化合物为漆黄素。

化合物14的[M-H]-离子峰为m/z269，推测该化合物的分子式为C15H10O5。二级质谱主要碎片离子m/z241、225和133由丢失CO(M-H-28u)、CO2(M-H-44u)和C7H4O3(M-H-136u)获得。CO可能是C环4位的脱羰基引起的，CO2可能是C环的脱羰基和脱醚基引起的，碎片离子m/z133和丢失碎片子m/z136 可能是C环1位和2位发生的RDA裂解，将这些信息与文献[19]报道漆树中相关活性物质进行比对，推断该化合物为硫黄菊素。

化合物15的[M-H]-离子峰为m/z271，推测该化合物的分子式为C15H12O5。二级质谱主要碎片离子m/z253、151和135由丢失H2O(M-H-18u)、C7H4O2(M-H-120u)和C8H8O2(M-H-136u)获得。H2O可能是B环上3位和4位上的羟基脱水引起的，碎片离子m/z151和丢失碎片m/z120 可能是C环0位和3位发生的RDA裂解，碎片离子m/z135和丢失碎片m/z136 可能是C环1位和3位发生的RDA裂解，将这些信息与文献[20]报道漆树中相关活性物质进行比对，推断该化合物为紫铆花素。

化合物16的[M-H]-离子峰为m/z417，推测该化合物的分子式为C21H22O9。二级质谱图主要碎片离子m/z399、253和209由丢失H2O(M-H-18u)、C6H10O4(M-H-18u-146u)和CO2(M-H-18u-146u-44u)获得。H2O可能是A环上的羟基脱水引起的，碎片离子m/z255和丢失碎片m/z146 可能是脱糖基引起的，碎片离子m/z209和丢失碎片m/z44 可能是C环脱掉CO2，将这些信息与文献[18]进行比对，并与化合物9(3,4′,7-三羟基二氢黄酮醇)进行对比，推测该化合物可能为3,7-二羟基黄酮醇- 4′-鼠李糖苷。化合物1～7、9、13～16的结构如图2所示。

图2 化合物的化学结构Fig.2 The structures of the Compounds

2.3 讨论

DPPH·、 ABTS·和OH·清除能力是化合物体外抗氧化能力评价的主要反应体系。通过表1可知，漆树木粉乙酸乙酯相显示出最强的自由基清除能力，前期的研究表明[21]，漆树木粉乙酸乙酯相含有大量的多酚化合物(53.43%)，说明乙酸乙酯相的抗氧化能力与其含有多酚化合物有很大的相关性。通过HPLC-MS的分子离子峰、一级质谱、二级质谱以及参考相关文献从漆树木粉乙酸乙酯相中鉴定出的活性物质分为黄酮类和酚酸类。

黄酮类化合物是漆树中的主要活性物质。从漆树中已经分离鉴定的黄酮类化合物有黄颜木素、3,4′,7-三羟基二氢黄酮醇、漆黄素、硫黄菊素、紫铆花素、紫铆因、花旗松素、二氢山柰酚和槲皮素等[20]。本研究鉴定出了漆树中含有的6种黄酮类化合物，分别为：黄颜木素、3,4′,7-三羟基二氢黄酮醇、漆黄素、硫黄菊素、紫铆花素和3,7-二羟基黄酮醇- 4′-鼠李糖苷。通过HPLC-MS分析可知中国漆树中含有3,7-二羟基黄酮醇- 4′-鼠李糖苷，但其糖苷键的位置还有待于进一步证实。黄酮化合物具有C6-C3-C6结构，由于含有多酚羟基，使其有较强的生理活性，漆黄素具有抗氧化、抗癌、抗过敏、抗炎、治疗糖尿病和神经保护等作用[22]，紫铆花素具有增白、抑制着床和抑制DNA损伤氧化作用[23]，硫黄菊素具有减少氧化压力、血小板聚集和突变发生作用[24]。黄酮类化合物的抗氧化活性强弱与酚羟基的数量、有无糖苷键、C2与C3位有无双键以及C3′与C4′有无邻二羟基有关[25]。因此可以初步推断漆黄素、硫黄菊素和紫铆花素对漆树木粉乙酸乙酯相的抗氧化活性贡献较大。

从漆树木粉乙酸乙酯相鉴定出6种酚酸类化合物分别为：对乙氧基-3-羟基苯甲酸、没食子酸、3,4-二羟基杏仁酸、没食子酸十六烷酯、原儿茶酸和没食子酸乙酯。其中韩国漆树中检测到没食子酸和原儿茶酸，HPLC-MS分析得到中国漆树除以上2种成分外，还检测到了对乙氧基-3-羟基苯甲酸、3,4-二羟基杏仁酸、没食子酸十六烷酯和没食子酸乙酯。酚酸类化合物的抗氧化活性与酚羟基的位置、数量及取代基团相关，没食子酸和原儿茶酸是重要的酚酸类物质，其抗氧化活性已被大量证实[26]，因此，可以初步推断3,4-二羟基杏仁酸、没食子酸乙酯对漆树木粉乙酸乙酯相的抗氧化活性贡献也较大。

3 结 论

3.1 采用不同有机溶剂逐级萃取漆树乙醇提取物，得到石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相，通过测定体外清除DPPH自由基(DPPH·)、 ABTS自由基(ABTS·)和羟基自由基(OH·)的能力比较了4个萃取相的抗氧化活性。结果表明：乙酸乙酯相的萃取得率最高，为60.1%，对DPPH·、 ABTS·和·OH具有最强的清除作用，其半数抑制质量浓度(IC50)值分别为19.9、 29.74和37.95 mg/L。

3.2 通过HPLC-MS分析漆树木粉乙酸乙酯相中的主要化学成分，从质谱图中共识别16种分子质量的化合物，根据化合物的一级质谱和二级质谱的特征离子峰，总共鉴定出12种化合物，其中6种为酚酸类化合物，分别为对乙氧基-3-羟基苯甲酸(1)、没食子酸(2)、 3,4- 二羟基杏仁酸(3)、没食子酸十六烷酯(4)、原儿茶酸(5)、没食子酸乙酯(7)；另外6种为黄酮类化合物，分别为黄颜木素(6)、 3,4′,7-三羟基二氢黄酮醇(9)、漆黄素(13)、硫黄菊素(14)、紫铆花素(15)和3,7-二羟基黄酮醇- 4′-鼠李糖苷(16)。

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HPLC-MS Analysis of Antioxidant Components from
RhusvernicifluaStokes Wood Powder

CHEN Hongxia1, WANG Chengzhang1,2, ZHOU Hao1,2, TAO Ran1, YE Jianzhong1

(1.Institute of Chemical Industry of Forest Products,CAF;National Engineering Lab.for Biomass Chemical Utilization;Key and Open Lab.of Forest Chemical Engineering,SFA;Key Lab.of Biomass Energy and Material,Jiangsu Province,
Nanjing 210042， China; 2.Research Institute of Forestry New Technology,CAF, Beijing 100091，China)

The ethanol extract fromRhusvernicifluaStokes wood powder was partitioned with different polarity solvents to obtain petroleum ether fraction, ethyl acetate fraction,n-butylalcohol fraction and water fraction. The DPPH·, ABTS· and OH· scavenging activities of the four fractions were evaluated. The results showed that the extraction yield of ethyl acetate was the highest (60.1%) and its scavenging activities of DPPH·, ABTS· and OH· were the strangest with the IC50of 19.9, 29.74 and 37.95 mg/L, respectively. Twelve compounds in ethyl acetate fraction were identified by HPLC-MS, including six phenolic acids, i.e., ethoxy-3-hydroxy benzoic acid(1), gallic acid(2), 3,4-dihydroxy almond acid(3), gallic acid cetyl ester(4), protocatechuic acid(5) and ethyl gallate(7) and six flavonoids, i.e., fustin(6), 3,4′,7-trihydroxy-flavanonol(9), fisetin(13), sulfuretin(14), butin(15) and 3,7-dihydroxy flavanone- 4′-rhamnose(16).

RhusvernicifluaStokes; wood powder; antioxidant; active component; HPLC-MS

10.3969/j.issn.0253-2417.2017.01.012

2016- 05- 05

国家林业局948技术引进项目(2016-4-07)；国家国际科技合作专项(2014DFR31300)

陈虹霞(1983— )，女，浙江舟山人，助理研究员，博士，主要从事天然产物化学的研究；E-mail：shirenyahui@126.com

*通讯作者：王成章，研究员，博士，博士生导师，主要从事天然产物研究与利用方面的工作；E-mail:wangczlhs@sina.com。

TQ35

A

0253-2417(2017)01- 0094- 07

陈虹霞，王成章，周昊，等.漆树木粉抗氧化活性成分的HPLC-MS分析[J].林产化学与工业，2017，37(1)：94-100.