自噬异常与炎症性肠病发病的关系*

宋杨达 钟英强

中山大学孙逸仙纪念医院消化内科(510120)

·综 述·

自噬异常与炎症性肠病发病的关系*

宋杨达 钟英强#

中山大学孙逸仙纪念医院消化内科(510120)

炎症性肠病(IBD)患者体内存在细胞自噬功能低下的现象。ATG16L1、NOD2、IRGM等自噬相关基因的单核苷酸多态性(SNP)与IBD的易感性有关。自噬可能通过免疫应答与耐受、胞内菌感染、免疫调节功能与Paneth细胞功能异常以及内质网应激等过程影响IBD的发病。本文就自噬异常与IBD发病的关系作一综述。

自噬； 炎症性肠病； 多态性,单核苷酸； 免疫

炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一组病因尚未完全清楚的肠道慢性非特异性炎症性疾病，主要包括克罗恩病(Crohn’s disease,CD)、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)和未定型结肠炎(intermediate colitis,IC)。随着人类基因组计划的开展，人们已通过全基因组关联研究(genome-wide association studies,GWAS)发现160余个与IBD发病相关的基因位点[1]。多种自噬相关基因的单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphisms,SNP)被发现与IBD的易感性有关，使人们开始关注自噬与IBD的关系。

自噬是指细胞自身物质被包裹吞噬并在自身溶酶体中降解消化的过程。在一些因素(如饥饿、缺血缺氧、感染等)的影响下，组织细胞可通过自噬途径降解细胞内受损的细胞器、无用的蛋白质和核酸等物质，并重新利用这些原料，增强自身生存力，维持细胞稳态[2]。此外，自噬在维持机体免疫稳态中起有重要作用，包括参与机体固有免疫和适应性免疫应答、免疫耐受、免疫调节等过程。目前发现自噬功能失衡与多种疾病密切相关，如IBD、感染、神经退行性病变、肿瘤和自身免疫病等[3]。本文就自噬与IBD的关系及其可能的作用机制作一综述。

一、自噬分类和途径

作为一种在进化上比较保守的细胞代谢过程，自噬与其他降解途径(如蛋白酶体)不同，可吞噬并消化降解一些较大的物质，如老化的细胞器、异常的蛋白聚集体，甚至是入侵的病原体。根据细胞内物质转运到溶酶体的途径不同，自噬可分为巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)、分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy)等[4]。巨自噬是自噬的主要形式，大致过程如下：待降解物质被非溶酶体起源的双层膜结构包裹，形成自噬体(autophagosome)，再与溶酶体融合，形成自噬溶酶体，最后在溶酶体酶作用下，自噬溶酶体内的物质被降解。

二、自噬相关基因多态性与IBD

对IBD易感基因的研究已发现多个自噬相关基因及其SNP位点，如ATG16L1、NOD2、IRGM等，均被证实与IBD发病相关。

1.ATG16L1：ATG16L1是自噬体形成过程中的一种关键蛋白质，位于人染色体2q37.1。ATG16L1可与ATG12和ATG5相互作用形成ATG12-ATG5-ATG16L1共轭复合体，招募微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3)，后者可与磷脂酰乙醇胺连接，有助于自噬膜延伸，形成自噬体[5]。研究[6]发现，ATG16L1缺陷的细胞无法合成ATG12-ATG5-ATG16L1蛋白复合体，从而抑制自噬体的形成。ATG16L1缺陷小鼠对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎更易感，白细胞介素(interleukin,IL)-1β和IL-18较对照组明显升高。此外，小鼠ATG16L1基因的表达被抑制后，肠道Paneth细胞内的颗粒数减少且形态异常，ATG16L1基因突变的CD患者Paneth细胞也存在类似改变，说明ATG16L1对Paneth细胞的功能有影响[7]。

Hampe等[8]通过GWAS分析发现一个与欧美白种人群CD发病相关的ATG16L1基因SNP突变位点rs2241880(T300A)。该突变使ATG16L1基因N端第300位上的苏氨酸(Thr)变为丙氨酸(Ala)，且其发生在进化保守的WD重复区。研究[9]发现，携带T300A突变纯合子的CD患者肠道狭窄的发生率更高，且病情容易复发，需早期加用免疫抑制剂干预。但在中国汉族人群中尚未发现ATG16L1基因T300A突变与CD的关系，说明CD相关的ATG16L1基因多态性改变可能存在地域和种族差异。

2.NOD2/CARD15：NOD2属于NOD样受体家族，是一类重要的模式识别受体，可识别病原相关分子模式，从而在固有免疫中发挥作用[10]。NOD2能识别细菌的胞壁酰二肽，诱导炎症小体NLRP3形成，激活下游MAPK、NF-κB通路，然后通过自身的caspase活化募集结构域(caspase-activating and recruitment domain,CARD)招募和激活caspase-1，释放炎症因子如IL-1β和IL-18，进一步引起免疫反应。此外，NOD2还可通过CARD结构域与ATG16L1的WD40结构域相互作用，从而诱导细胞对入侵病原体的自噬过程[11]。

NOD2是第一个被发现的CD易感基因，后被命名为CARD15。在欧美人群中，NOD2/CARD15基因常见SNP位点目前主要包括rs2066844(R702W)、rs2066845(G908R)、rs41450053(L1007fsC)等[12]。研究[13]发现NOD2突变纯合子罹患CD的危险度是正常人的20～40倍，且发病年龄更小，临床表现更严重，如发生回肠狭窄和需要手术干预的概率增加。然而，上述SNP位点在亚洲和非洲南部国家中均未发现与IBD有明显关联，且这些国家的IBD发病率远低于北欧和北美国家[14]，这或许也证实了NOD2/CARD15基因异常对IBD发病的促进作用。

NOD2基因SNP改变与CD发病关系的研究[11]发现，L1007insC突变的NOD2基因编码的蛋白序列较正常序列短，导致招募的ATG16L1无法与细胞膜连接，自噬过程受阻，使病原体在细胞内长期存在而出现慢性炎症。此外，NOD2基因3020insC突变还可通过抑制IL-10转录使其表达下降，抑制抗炎作用。这可能是CD发病过程中肠道过度炎症反应的发生原因之一[15]。

3.IRGM：IRGM基因位于人染色体5q33.1上，其编码的蛋白属于免疫相关GTP酶家族。Singh等[16]发现IRGM可诱导自噬产生，协助清除入侵细胞的结核分支杆菌。GWAS分析[17-18]显示，IRGM基因多态性与CD密切相关，如rs10065172和rs13361189等。研究[19]发现，IRGM基因敲除小鼠的肠道Paneth细胞发生了定位异常和分泌颗粒的形态改变，且这种小鼠对DSS诱导的结肠炎更易感。上述研究均提示IRGM可通过影响自噬的功能来诱发IBD。

三、自噬与IBD发病机制的关系

自噬作为一种进化上高度保守的生理过程，广泛参与机体生长、更新和免疫防御功能。根据自噬相关基因与IBD的关系，自噬可能通过以下机制参与IBD的发病过程。

1.自噬与免疫应答和耐受：自噬参与细胞内抗原的加工处理并通过MHC-Ⅱ类途径将抗原呈递至CD4+T细胞，诱导进一步的免疫反应[20]。自噬缺陷可影响细菌抗原肽的呈递，使胞内感染持续存在，形成慢性炎症[21]。

此外，自噬还参与了T细胞在胸腺发育过程中的阳性和阴性选择[22]。自噬缺陷小鼠胸腺中CD4+T细胞的阴性选择受阻，使对自身组织抗原起反应的异常T细胞继续发育成熟，并可在全身组织中浸润，导致多器官的自身免疫性炎症，其中结肠炎症表现类似CD[23]。自噬缺陷导致机体对肠道共生菌和自身抗原的免疫耐受降低，使肠道适应性免疫增强，诱发异常炎症反应，这可能是IBD的发病机制之一。

2.自噬与胞内菌感染：自噬除可通过MHC-Ⅱ呈递途径促进适应性免疫清除感染外，还可直接吞噬清除入侵的病原体。肠道菌群失衡和细菌持续感染可能是IBD的病因。累及回肠的CD患者肠上皮细胞内常伴有黏附侵袭性大肠杆菌(adherent-invasiveEscherichiacoli,AIEC)感染。Lapaquette等[24]发现，生理水平的自噬可有效抑制AIEC的增殖，而IRGM和ATG16L1基因缺陷的细胞内则有大量AIEC增殖。Nguyen等[25]的研究结果显示，AIEC可通过NF-κB通路上调肠上皮细胞microRNA-30C和microRNA-130A水平，从而降低ATG5和ATG16L1的表达，抑制自噬过程，有助于AIEC的存活和进一步入侵。上述研究均证实了自噬缺陷和AIEC感染与CD发病的关系。自噬缺陷导致胞内菌清除能力降低，使胞内感染持续存在，招募更多的炎性细胞浸润，引起细胞因子过度分泌并形成慢性肉芽肿，这些效应可能均与CD的发病相关。

3.自噬与免疫调节功能：自噬可通过多种途径调节免疫应答，抑制炎症反应的过度发生。

首先，自噬可下调NF-κB的活化。NF-κB信号通路的活化是多数病原物介导炎症的关键。在炎症反应激活T细胞的同时，自噬能通过选择性地抑制衔接蛋白BCL10复合体的形成来下调NF-κB活性，防止其过度激活[26]。

其次，自噬可抑制炎症小体激活。炎症小体是一种多蛋白复合体，在感染或其他应激时，可通过调节caspase-1活化，使炎性细胞因子前体pro-IL-1β和pro-IL-18切割成熟，促进机体的炎症反应过程。自噬抑制炎症小体激活的机制主要有以下两个方面：①自噬可通过降解异常的蛋白聚集物、老化缺陷的细胞器等细胞内残余废物，来阻止这些内源性致炎物激活炎症小体[27-28]；②自噬通过降解炎症小体组分，来抑制其激活[29]。

第三，自噬还可影响T细胞分化。研究[30]表明，自噬能通过下调IL-1α和IL-1β等T细胞分化必需细胞因子的分泌来抑制T细胞向Th17细胞分化。而ATG5缺陷的结核感染小鼠肺组织中发现Th17细胞浸润明显增多，炎症的病理表现亦更严重。

4.自噬与Paneth细胞功能异常：Paneth细胞是一类位于肠腺基底部的细胞，作为肠道抗菌生物屏障的重要组成部分，能通过分泌溶菌酶和防御素等杀菌物质，溶解肠道细菌的细胞壁。Cadwell等[7]发现ATG16L1和ATG5缺陷小鼠中Paneth细胞分泌杀菌物质的能力显著下降，且临床表现类似于人类CD。在ATG16L1缺陷CD患者中，Paneth细胞的分泌功能异常，可能通过削弱肠道抗菌生物屏障，改变了正常肠道菌群，引起肠道损伤和慢性炎症的发生。

5.自噬与内质网应激：内质网是细胞内与蛋白折叠修饰、转运和分泌功能有关的一种重要细胞器。在多种应激因素刺激下，内质网的正常功能可受到影响，导致蛋白未折叠或错误折叠，此过程称为内质网应激。肠道内质网应激可导致Paneth细胞和杯状细胞分泌功能(如抗菌肽和黏蛋白等)异常，使正常肠道抗菌和黏蛋白屏障受损[31]，进而引起持续的炎症刺激，促进IBD的发生。自噬有助于降解内质网产生的异常折叠蛋白，维持内环境稳态。自噬缺陷小鼠的内质网应激反应加重，NF-κB和TNF信号通路增强，可引起类似于CD表现的自发性回肠炎[32]。上述研究结果提示自噬和内质网应激可能与IBD发生有密切的关系。

四、结语

基因的功能学研究提示，自噬可通过多种途径来维持自身内环境稳定。目前已明确，自噬可影响抗原呈递、幼稚T细胞的阴性选择与免疫耐受、T细胞增殖和分化、炎症小体和炎性细胞因子分泌等过程。但目前仍有一些问题需深入研究，如自噬除可影响Th17细胞分化外，对T细胞其他亚群是否有影响；自噬与免疫系统网络和肠道共生菌群的复杂关系和具体作用机制等。这些问题的解决有助于深入理解自噬相关基因功能的改变对IBD发病的影响，并为IBD的临床诊断和治疗带来启发。目前已有不少研究开始应用自噬诱导剂来治疗IBD，取得了不错的效果，如有病例报道应用雷帕霉素治疗1例难治性CD患者，其症状明显改善，黏膜愈合良好[33]。随着研究的进一步深入，上调自噬功能将可能成为IBD治疗的新靶点和方向。

1 Jostins L,Ripke S,Weersma RK,et al.Host-microbe interactions have shaped the genetic architecture of inflammatory bowel disease[J].Nature,2012,491 (7422):119-124.

2 Deretic V,Saitoh T,Akira S.Autophagy in infection,inflammation and immunity[J].Nat Rev Immunol,2013,13 (10):722-737.

3 Ramos PS,Criswell LA,Moser KL,et al;International Consortium on the Genetics of Systemic Erythematosus.A comprehensive analysis of shared loci between systemic lupus erythematosus (SLE) and sixteen autoimmune diseases reveals limited genetic overlap[J].PLoS Genet,2011,7 (12):e1002406.

4 Mizushima N,Komatsu M.Autophagy:renovation of cells and tissues[J].Cell,2011,147 (4):728-741.

5 Fujita N,Itoh T,Omori H,et al.The Atg16L complex specifies the site of LC3 lipidation for membrane biogenesis in autophagy[J].Mol Biol Cell,2008,19 (5):2092-2100.

6 Saitoh T,Fujita N,Jang MH,et al.Loss of the autophagy protein Atg16L1 enhances endotoxin-induced IL-1beta production[J].Nature,2008,456 (7219):264-268.

7 Cadwell K,Liu JY,Brown SL,et al.A key role for autophagy and the autophagy gene Atg16l1 in mouse and human intestinal Paneth cells[J].Nature,2008,456 (7219):259-263.

8 Hampe J,Franke A,Rosenstiel P,et al.A genome-wide association scan of nonsynonymous SNPs identifies a susceptibility variant for Crohn disease in ATG16L1[J].Nat Genet,2007,39 (2):207-211.

9 Strisciuglio C,Auricchio R,Martinelli M,et al.Autophagy genes variants and paediatric Crohn’s disease phenotype:a single-centre experience[J].Dig Liver Dis,2014,46 (6):512-517.

10 Franchi L,Warner N,Viani K,et al.Function of Nod-like receptors in microbial recognition and host defense[J].Immunol Rev,2009,227 (1):106-128.

11 Travassos LH,Carneiro LA,Ramjeet M,et al.Nod1 and Nod2 direct autophagy by recruiting ATG16L1 to the plasma membrane at the site of bacterial entry[J].Nat Immunol,2010,11 (1):55-62.

12 van der Linde K,Boor PP,Houwing-Duistermaat JJ,et al.CARD15 mutations in Dutch familial and sporadic inflammatory bowel disease and an overview of European studies[J].Eur J Gastroenterol Hepatol,2007,19 (6):449-459.

13 Seiderer J,Brand S,Herrmann KA,et al.Predictive value of the CARD15 variant 1007fs for the diagnosis of intestinal stenoses and the need for surgery in Crohn’s disease in clinical practice:results of a prospective study[J].Inflamm Bowel Dis,2006,12 (12):1114-1121.

14 Ozen SC,Dagli U,Kiliç MY,et al.NOD2/CARD15,NOD1/CARD4,and ICAM-1 gene polymorphisms in Turkish patients with inflammatory bowel disease[J].J Gastroenterol,2006,41 (4):304-310.

15 Philpott DJ,Girardin SE.Crohn’s disease-associated Nod2 mutants reduce IL10 transcription[J].Nat Immunol,2009,10 (5):455-457.

16 Singh SB,Davis AS,Taylor GA,et al.Human IRGM induces autophagy to eliminate intracellular mycobacteria[J].Science,2006,313 (5792):1438-1441.

17 Parkes M,Barrett JC,Prescott NJ,et al.Sequence variants in the autophagy gene IRGM and multiple other replicating loci contribute to Crohn’s disease susceptibility[J].Nat Genet,2007,39 (7):830-832.

18 McCarroll SA,Huett A,Kuballa P,et al.Deletion polymorphism upstream of IRGM associated with altered IRGM expression and Crohn’s disease[J].Nat Genet,2008,40 (9):1107-1112.

19 Liu B,Gulati AS,Cantillana V,et al.Irgm1-deficient mice exhibit Paneth cell abnormalities and increased susceptibility to acute intestinal inflammation[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2013,305 (8):G573-G584.

20 Schmid D,Pypaert M,Münz C.Antigen-loading compartments for major histocompatibility complex class Ⅱ molecules continuously receive input from autophagosomes[J].Immunity,2007,26 (1):79-92.

21 Pua HH,Dzhagalov I,Chuck M,et al.A critical role for the autophagy gene Atg5 in T cell survival and proliferation[J].J Exp Med,2007,204 (1):25-31.

22 Bronietzki AW,Schuster M,Schmitz I.Autophagy in T-cell development,activation and differentiation[J].Immunol Cell Biol,2015,93 (1):25-34.

23 Nedjic J,Aichinger M,Emmerich J,et al.Autophagy in thymic epithelium shapes the T-cell repertoire and is essential for tolerance[J].Nature,2008,455 (7211):396-400.

24 Lapaquette P,Glasser AL,Huett A,et al.Crohn’s disease-associated adherent-invasiveE.coliare selectively favoured by impaired autophagy to replicate intracellularly[J].Cell Microbiol,2010,12 (1):99-113.

25 Nguyen HT,Dalmasso G,Müller S,et al.Crohn’s disease-associated adherent invasiveEscherichiacolimodulate levels of microRNAs in intestinal epithelial cells to reduce autophagy[J].Gastroenterology,2014,146 (2):508-519.

26 Paul S,Kashyap AK,Jia W,et al.Selective autophagy of the adaptor protein Bcl10 modulates T cell receptor activation of NF-κB[J].Immunity,2012,36 (6):947-958.

27 Zhou R,Yazdi AS,Menu P,et al.A role for mitochondria in NLRP3 inflammasome activation[J].Nature,2011,469 (7329):221-225.

28 Nakahira K,Haspel JA,Rathinam VA,et al.Autophagy proteins regulate innate immune responses by inhibiting the release of mitochondrial DNA mediated by the NALP3 inflammasome[J].Nat Immunol,2011,12 (3):222-230.

29 Leavy O.Quieting the inflammasome[J].Nat Rev Immunol,2012,12 (3):150.

30 Castillo EF,Dekonenko A,Arko-Mensah J,et al.Autophagy protects against active tuberculosis by suppressing bacterial burden and inflammation[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2012,109 (46):E3168-E3176.

31 Adolph TE,Tomczak MF,Niederreiter L,et al.Paneth cells as a site of origin for intestinal inflammation[J].Nature,2013,503 (7475):272-276.

32 Heazlewood CK,Cook MC,Eri R,et al.Aberrant mucin assembly in mice causes endoplasmic reticulum stress and spontaneous inflammation resembling ulcerative colitis[J].PLoS Med,2008,5 (3):e54.

33 Massey DC,Bredin F,Parkes M.Use of sirolimus (rapamycin) to treat refractory Crohn’s disease[J].Gut,2008,57 (9):1294-1296.

(2016-10-04收稿；2016-11-10修回)

Relationship between Autophagy Abnormalities and Pathogenesis of Inflammatory Bowel Disease

SONGYangda,ZHONGYingqiang.

DepartmentofGastroenterology,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou(510120)

ZHONG Yingqiang,Email:zhongyingqiang@126.com

Autophagy dysfunction is present in patients with inflammatory bowel disease (IBD),and the single-nucleotide polymorphisms (SNP) of autophagy related genes ATG16L1,NOD2 and IRGM might contribute to an increased susceptibility to IBD.Autophagy might participate in the pathogenesis of IBD through immune response and tolerance,intracellular bacterial infection,abnormalities in immune regulation and Paneth cells,and endoplasmic reticulum stress.This article reviewed the relationship between autophagy abnormalities and pathogenesis of IBD.

Autophagy; Inflammatory Bowel Disease; Polymorphisms,Single Nucleotide; Immune

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.05.011

国家自然科学资金面上项目(81370499)、广东省自然科学基金资助项目(2014-A030313020)

#本文通信作者，Email:zhongyingqiang@126.com