Bcl-2基因扩增和蛋白表达与原发性胃肠道弥漫大B细胞淋巴瘤临床病理特征和免疫表型的关系

韩 琪 范姝琼 张子臻 沈丹平 刘佳骅 陈奕宽 韩虎林 付海花 苏欣莹 殷晓璐 倪醒之#

上海交通大学医学院附属仁济医院胃肠外科1(200127) 阿斯利康投资(中国)有限公司2

·论 著·

Bcl-2基因扩增和蛋白表达与原发性胃肠道弥漫大B细胞淋巴瘤临床病理特征和免疫表型的关系

韩 琪1*范姝琼2*张子臻1沈丹平1刘佳骅1陈奕宽1韩虎林2付海花2苏欣莹2殷晓璐2倪醒之1#

上海交通大学医学院附属仁济医院胃肠外科1(200127) 阿斯利康投资(中国)有限公司2

背景：Bcl-2基因转录异常与结内弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)关系密切，对Bcl-2与原发性胃肠道DLBCL(PGI-DLBCL)的关系则缺乏充分研究。目的：探讨PGI-DLBCL中Bcl-2基因扩增和蛋白表达与肿瘤临床病理特征、免疫表型和预后的关系。方法：采集136例手术治疗PGI-DLBCL患者的临床资料，电话随访生存信息。以荧光原位杂交技术检测肿瘤组织Bcl-2基因扩增，免疫组化法检测Bcl-2蛋白表达，分析两者与肿瘤临床病理特征、免疫表型和预后的关系。结果：136例患者中，33例(24.3%)Bcl-2基因扩增阳性，90例(66.2%)Bcl-2蛋白表达阳性；基因扩增与肿瘤原发部位、Ann Arbor分期、血清乳酸脱氢酶水平、B症状、国际预后指数(IPI)评分相关(P<0.05)，蛋白表达与肿瘤原发部位和免疫表型相关(P<0.05)。Bcl-2基因扩增阳性患者和免疫表型为非GCB型的Bcl-2蛋白表达阳性患者5年总生存率(OS)分别显著低于相应阴性患者(41.5%对71.5%,P<0.05;54.6%对84.6%,P<0.05)。Bcl-2基因扩增或蛋白表达阳性患者中，CHOP化疗的5年OS显著低于利妥昔单抗联合CHOP化疗(48.6%对80.3%,P<0.05;66.4%对83.4%,P<0.05)。结论：检测Bcl-2基因扩增对PGI-DLBCL的预后判断具有重要意义，检出Bcl-2基因扩增者预后较差。非GCB型PGI-DLBCL中，Bcl-2蛋白表达与预后不良相关。利妥昔单抗可提高Bcl-2基因扩增或蛋白表达阳性患者的生存率。

胃肠肿瘤； 淋巴瘤，大B细胞，弥漫性； 免疫表型分型； 预后

原发性胃肠道弥漫大B细胞淋巴瘤(primary gastrointestinal diffuse large B-cell lymphoma,PGI-DLBCL)是胃肠道恶性淋巴瘤中最常见的病理类型，与其他淋巴瘤或胃肠道恶性肿瘤在临床特征等方面具有相似性，早期诊断困难，误诊率较高。不同免疫表型PGI-DLBCL的预后差异较大[1-2]，部分患者肿瘤侵袭性高，对常规化疗不敏感，预后较差。B细胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)基因具有细胞凋亡抑制作用，可通过延长细胞生存、阻止细胞凋亡而使细胞发生恶性转化，对正常B细胞的发育、分化亦起重要作用。研究证实Bcl-2基因转录 异常与结内DLBCL关系密切[3-4]，而在PGI-DLBCL中，Bcl-2与肿瘤间的关系有待进一步研究。本研究通过检测PGI-DLBCL中的Bcl-2基因扩增、蛋白表达并分析其与肿瘤临床病理特征、免疫表型和预后的关系，为PGI-DLBCL的预后评估和靶向治疗提供一定的理论依据。

对象与方法

一、研究对象

纳入2001年6月—2015年12月在上海仁济医院胃肠外科接受手术治疗的PGI-DLBCL患者136例。纳入条件：①无其他肿瘤病史、免疫系统疾病史和器官移植史；②原发性DLBCL，排除复发病例；③术前未接受放化疗；④切片经病理医师复核，符合Dawson提出的原发性胃肠道淋巴瘤诊断标准，DLBCL诊断标准参照WHO“造血和淋巴组织肿瘤性疾病”新分类(2016)；⑤临床资料完整。

二、主要试剂

Bcl-2 SpectrumRed探针(Enzo Life Sciences,Inc.)；CEP8 SpectrumGreen探针(Vysis,Abbott Labor-atories)；DAPI复染剂(Vector Laboratories)；小鼠抗人Bcl-2单克隆抗体、EnVison+/HRP(小鼠)(Dako,Agilent Technologies)。

三、方法

1.荧光原位杂交(FISH)检测Bcl-2基因扩增：此步骤中FISH探针由两部分组成，CEP8探针以SpectrumGreen标记，为绿色荧光；Bcl-2基因特异性位点探针以SpectrumRed标记，为红色荧光。3 μm厚肿瘤组织切片56 ℃烤片过夜，二甲苯脱蜡，乙醇脱水，经蛋白酶处理后滴加探针混合液，79 ℃变性6 min，37 ℃杂交48 h，去除盖玻片，75.5 ℃杂交后洗液(0.3% NP40/23 SSC)和室温杂交后洗液(23 SSC)分别洗涤2 min以洗去多余的探针混合液，DAPI复染细胞核并封固，在荧光显微镜下分别经红色、绿色和蓝色滤光片捕获不同荧光。每例随机选择50个大小一致、边界完整、DAPI染色均一、无重叠的细胞核进行观察。细胞核内出现3个或3个以上红色信号判定为Bcl-2基因扩增[5]。

2.免疫组化染色检测Bcl-2蛋白表达：采用EnVision二步法。4 μm厚肿瘤组织切片二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，高温高压抗原修复，阻断内源性过氧化物酶，滴加小鼠抗人Bcl-2单克隆抗体，室温孵育60 min，滴加二抗EnVison+/HRP(小鼠)，37 ℃孵育30 min，DAB显色0～15 min，光学显微镜下观察。阳性细胞数≤25%判定为Bcl-2蛋白表达阴性，>25%判定为Bcl-2蛋白表达阳性[5]。

3.临床资料采集和随访：通过查阅病例采集136例患者的相关临床病理资料，包括性别、年龄、肿瘤 原发部位、Ann Arbor分期、血清乳酸脱氢酶(LDH)水平、有无B症状、国际预后指数(International Prognostic Index,IPI)评分、免疫表型[生发中心B细胞样(germinal center B cell-like,GCB)型和非GCB型]和治疗方案[6-8]。全部病例以电话形式进行随访，截止时间为2016年5月30日，随访内容包括一般状况和近期复查情况。生存时间定义为手术治疗日至末次随访时间或死亡时间，以月为单位。

四、统计学分析

本报讯继广东、广西、云南之后，四川成为柑橘种植新的风口。据悉，短短3年时间，四川省柑橘扩种面积高达200万亩，并保持每年60余万亩的增速，2017年四川柑橘种植面积突破了600万亩。但是在四川柑橘种植业繁荣发展的背后，也隐藏不少产区痛点问题，如因长期不合理施肥而导致的土壤酸化和土壤板结，因施肥理念较为落后而导致肥料利用率过低、产量大小年等等。这些问题不仅仅影响着广大种植户的收益，更是制约着整个四川柑橘产业的可持续发展。

结 果

一、一般情况

136例 PGI-DLBCL患者中男性82例，女性54例，男女比例1.52∶1，年龄18～86岁，中位年龄62岁，<60岁58例，≥60岁78例。随访时间1～174个月，平均生存时间(52.3±41.3)个月，中位生存时间41.0个月。随访期内87例(64.0%)患者存活，49 例(36.0%)死亡，3年总生存率(overall survival,OS)为72.2%，5年OS为 64.5%。

胃DLBCL 82例(60.3%)，其中胃体45例，胃窦25例，贲门5例，弥漫性5例，多发病灶2例；肠DLBCL 54例(39.7%)，其中回盲部22例，小肠14例，升结肠13例，乙状结肠1例，多发病灶4例。IPI评分0～2分即低/低中危84例(61.8%)，3～5分即中高/高危52例(38.2%)。92例(67.6%)患者术后接受化疗，44例(32.4%)术后未接受化疗，5年OS分别为78.4%和35.4%；术后化疗者中50例(54.3%)采用CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、甲泼尼龙)方案化疗，42例(45.7%)采用利妥昔单抗(rituximab)联合CHOP(R-CHOP)方案化疗，5 年OS分别为74.1%和84.7%。

二、Bcl-2基因扩增情况及其与PGI-DLBCL临床病理特征和预后的关系

136例患者中33例(24.3%)Bcl-2基因扩增阳性，103例(75.7%)阴性(图1A、1B)。33例基因扩增阳性者中，Bcl-2蛋白表达阳性31例(93.9%)，阴性2例(6.1%)；103例基因扩增阴性者中，Bcl-2蛋白表达阳性59例(57.3%)，阴性44例(42.7%)。Bcl-2基因扩增与蛋白表达之间存在相关性(χ2=15.005,P=0.004)。

χ2检验显示，Bcl-2基因扩增阳性与肿瘤原发部位、Ann Arbor分期、血清LDH水平、B症状、IPI评分之间存在相关性(P<0.05)，与性别、年龄、肿瘤免疫表型无关(P>0.05)。原发于肠道、Ann Arbor Ⅲ-Ⅳ期、血清LDH升高、有B症状、IPI评分3～5分的PGI-DLBCL，Bcl-2基因扩增阳性率分别显著高于原发于胃、Ann ArborⅠ-Ⅱ期、LDH正常、无B症状和IPI评分0～2分者(表1)。

A：Bcl-2基因扩增阳性；B：Bcl-2基因扩增阴性；C：Bcl-2蛋白表达阳性；D：Bcl-2蛋白表达阴性

图1 PGI-DLBCL中Bcl-2基因扩增(FISH，×400)和蛋白表达(EnVision二步法，×400)

生存分析显示，Bcl-2基因扩增阳性组平均生存时间为(36.5±28.7)个月，中位生存时间为34.0个月；阴性组平均生存时间为(57.3±43.5)个月，中位生存时间为48.0个月。阳性组5年OS显著低于阴性组(41.5%对71.5%,P=0.000 4)(图2A)。

Bcl-2基因扩增阳性患者中，CHOP化疗组5年OS显著低于R-CHOP化疗组(48.6%对80.3%,P=0.034 9)(图2B)；Bcl-2基因扩增阴性患者中，CHOP与R-CHOP化疗组5年OS差异无统计学意义(82.2%对89.3%,P=0.615 7)(图2C)。

136例患者中90例(66.2%)Bcl-2蛋白表达阳性，46例(33.8%)阴性(图1C、1D)。

χ2检验显示，Bcl-2蛋白表达阳性与肿瘤原发部位和免疫表型之间存在相关性(P<0.05)，与性别、年龄、Ann Arbor分期、血清LDH水平、有无B症状、IPI评分无关(P>0.05)。原发于肠道和非GCB型PGI-DLBCL，Bcl-2蛋白表达阳性率分别显著高于原发于胃和GCB型PGI-DLBCL(表2)。

生存分析显示，Bcl-2蛋白表达阳性组平均生存时间为(50.2±40.7)个月，中位生存时间为40.0个月；阴性组平均生存时间为(56.3±42.5)个月，中位生存时间为48.0个月。阳性组5年OS低于阴性组，但差异无统计学意义(61.3%对79.1%,P=0.110 9)(图3A)。

表1 Bcl-2基因扩增与PGI-DLBCL临床病理特征的关系

Bcl-2蛋白表达阳性患者中，CHOP化疗组5年OS显著低于R-CHOP化疗组(66.4%对83.4%,P=0.028 7)(图3B)；Bcl-2蛋白表达阴性患者中，CHOP与R-CHOP化疗组5年OS差异无统计学意义(87.4%对90.0%,P=0.868 7)(图3C)。

进一步分析不同免疫表型PGI-DLBCL中Bcl-2蛋白表达与预后的关系。GCB型中，Bcl-2蛋白表达阳性与阴性组间5年OS差异无统计学意义(84.2%对 75.1%,P=0.720 6)(图4A)；非GCB型中，Bcl-2蛋白表达阳性组5年OS显著低于阴性组(54.6%对84.6%,P=0.047 6)(图4B)。

表2 Bcl-2蛋白表达与PGI-DLBCL临床病理特征的关系

图2 Bcl-2基因扩增和化疗方案与PGI-DLBCL预后的关系

图3 Bcl-2蛋白表达和化疗方案与PGI-DLBCL预后的关系

图4 不同免疫表型PGI-DLBCL中Bcl-2蛋白表达与预后的关系

讨 论

利用基因芯片技术可将DLBCL根据基因表达谱分为3种亚型，分别为GCB型、活化B细胞样(activated B cell-like,ABC)型和GCB、ABC同时低表达的第3型[9]，其中GCB型预后较好，ABC型与第3型预后相似，均明显差于GCB型。然而基因芯片技术复杂、价格昂贵、对组织标本要求较高，导致该分型方法的临床应用受到限制。而Hans等[10]提出的基于免疫组化染色的分型方法系根据Bcl-6、分化群10(cluster of differentiation 10,CD10)和黑色素瘤相关抗原1(melanoma-associated antigen 1,Mum-l)表达将DLBCL分为GCB型和非GCB型，其中非GCB型可能包括基因表达谱分型中的ABC型和第3型，GCB型预后优于非GCB型。Hans分型与基因表达谱分型的符合率接近86%，预后分析结果亦与之相一致，目前已被广泛认可和使用[1，11-12]。

本组136例PGI-DLBCL患者中24.3%检测到Bcl-2基因扩增，生存分析显示Bcl-2基因扩增阳性患者5年OS显著低于阴性者(41.5%对71.5%)，表明在PGI-DLBCL中，Bcl-2基因扩增与预后不良密切相关，与张子臻等[5]的研究结果一致。同时，本研究还发现Bcl-2基因扩增阳性与PGI-DLBCL原发于肠道、血清LDH水平升高、有B症状、Ann Arbor临床分期较晚和IPI评分中高危相关。上述结果表明Bcl-2基因扩增是PGI-DLBCL疾病进展的重要影响因素，检测Bcl-2基因扩增对PGI-DLBCL的预后判断具有重要意义，与国内研究提出的Bcl-2基因扩增在结外DLBCL中具有预后判断价值相一致[4]。

尽管本研究33例Bcl-2基因扩增阳性PGI-DLBCL患者中27例(81.8%)免疫表型为非GCB型，仅6例(18.2%)为GCB型，但相关性分析显示Bcl-2基因扩增与免疫表型无关，与本科室2000—2007年间PGI-DLBCL病例的分析结果一致[5]。蒋会勇等[4]对结内DLBCL的研究同样显示，虽然Bcl-2基因扩增患者大多为非GCB型，但基因扩增与免疫表型无关。鉴于上述研究样本量较小，Bcl-2基因扩增与胃肠道和结内DLBCL免疫表型的关系需扩大样本量作进一步研究。

本组PGI-DLBCL患者Bcl-2蛋白表达阳性率为66.2%。在各项临床病理参数中，Bcl-2蛋白表达阳性与性别、年龄、血清LDL水平、有无B症状、Ann Arbor临床分期和IPI评分均无关，而与肿瘤原发部位和免疫表型显著相关，非GCB型Bcl-2蛋白表达阳性率显著高于GCB型(74.0%对47.5%)。无论是在全组PGI-DLBCL还是在GCB型患者中，Bcl-2蛋白表达阳性与阴性组间5年OS差异均无统计学意义(61.3%对79.1%；84.2%对75.1%)；而在非GCB型患者中，Bcl-2蛋白表达阳性组5年OS显著低于阴性组(54.6%对84.6%)，即Bcl-2蛋白表达阳性仅在非GCB型患者中与预后不良相关。已知Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，其在GCB型与非GCB型DLBCL间的差异有助于加深对PGI-DLBCL发生、发展以及肿瘤凋亡生物学特征的了解。

Bcl-2基因染色体易位是引起DLBCL中Bcl-2蛋白过表达的原因之一，有研究显示其与Bcl-2蛋白高表达呈正相关[4]。理论上Bcl-2基因扩增也可引起Bcl-2蛋白高表达，但本科室前期研究[5]却未提示两者间的相关性。本研究样本量较前期研究有所增加，分析结果显示Bcl-2基因扩增与蛋白表达之间存在相关性(P=0.004)。然而在90例Bcl-2蛋白表达阳性患者中，仅31例(34.4%)Bcl-2基因扩增阳性，表明Bcl-2蛋白表达并不完全由Bcl-2基因扩增决定，其他如染色体易位、转录后调控、上下游调控信号通路异常、检测结果假阳性等因素均可能与Bcl-2蛋白表达阳性有关。

既往认为手术切除联合术后放化疗是局灶性PGI-DLBCL的首选治疗方案[13]。CHOP方案(环磷酰胺+阿霉素+长春新碱+泼尼松)是近30年来治疗DLBCL的标准化疗方案，总体缓解率为 80%～90%，完全缓解率为40%～50%，5年OS约30%～40%。随着免疫学和分子生物学研究的深入，利妥昔单抗联合CHOP的R-CHOP方案逐渐成为新的治疗DLBCL的一线标准治疗方案。利妥昔单抗是针对B细胞CD20抗原的人/鼠嵌合型单克隆抗体，能特异性结合B细胞上的CD20抗原，通过抗体依赖性细胞毒作用和补体介导的细胞毒作用两种途径杀伤B细胞，抑制B细胞增殖，诱导B细胞凋亡，并能提高肿瘤细胞的化疗敏感性[7]。利妥昔单抗可下调Bcl-2表达，从而增加caspase酶原降解活性产物和促凋亡蛋白Bax表达，加速肿瘤细胞凋亡，改善患者预后。本研究生存分析显示，Bcl-2基因扩增/蛋白表达阳性患者中，接受R-CHOP方案治疗者的预后显著优于接受CHOP方案治疗者，而在Bcl-2基因扩增/蛋白表达阴性患者中，两种方案的预后无明显差异，表明利妥昔单抗可改善Bcl-2基因扩增/蛋白表达阳性患者的生存率。因此，临床上可通过FISH或免疫组化方法检测Bcl-2基因扩增或蛋白表达以指导PGI-DLBCL的化疗用药。

综上所述，检测Bcl-2基因扩增对PGI-DLBCL的预后判断具有重要意义，检出Bcl-2基因扩增者预后较差。Bcl-2基因扩增与蛋白表达相关，但蛋白表达并不完全由基因扩增决定。Bcl-2蛋白表达参与了非GCB型PGI-DLBCL的发生、发展，并与预后不良相关。利妥昔单抗可提高Bcl-2基因扩增或蛋白表达阳性患者的生存率，临床上可通过FISH或免疫组化方法检测Bcl-2基因扩增或蛋白情况，对PGI-DLBCL患者进行预后评估并指导靶向治疗。

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5 张子臻，倪醒之，沈艳滢，等.胃肠道弥漫性大B细胞淋巴瘤中之t(14;18)染色体易位及Bcl-2基因扩增的研究[J].外科理论与实践,2010,15 (2):143-147.

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8 International Non-Hodgkin’s Lymphoma Prognostic Factors Project.A predictive model for aggressive non-Hodgkin’s lymphoma[J].N Engl J Med,1993,329 (14):987-994.

9 Wright G,Tan B,Rosenwald A,et al.A gene expression-based method to diagnose clinically distinct subgroups of diffuse large B cell lymphoma[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2003,100 (17):9991-9996.

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(2017-01-13收稿；2017-02-07修回)

Bcl-2 Gene Amplification and Protein Expression and Their Relationship with Clinicopathological Characteristics and Immunophenotype of Primary Gastrointestinal Diffuse Large B-cell Lymphoma

HANQi1,FANShuqiong2,ZHANGZizhen1,SHENDanping1,LIUJiahua1,CHENYikuan1,HANHulin2,FUHaihua2,SUXinying2,YINXiaolu2,NIXingzhi1.

1DepartmentofGastrointestinalSurgery,RenjiHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai(200127);2AstraZenecaR&D,Shanghai

NI Xingzhi,Email:georgeniwjc@163.com

Gastrointestinal Neoplasms; Lymphoma,Large B-Cell,Diffuse; Immunophenotyping; Prognosis

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.05.003

*本文共同第一作者：韩琪，Email:qq110hq@163.com；范姝琼，Email:Joan.Fan@astrazeneca.com

#本文通信作者，Email:georgeniwjc@163.com

Background:Aberrant Bcl-2 transcription is closely related with nodal diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL),however,the relationship between Bcl-2 and primary gastrointestinal DLBCL (PGI-DLBCL) was not fully studied.Aims:To investigate the relationship between Bcl-2 gene amplification and protein expression and clinicopathological characteristics,immunophenotype and prognosis of PGI-DLBCL.Methods:Clinical data was collected from 136 PGI-DLBCL patients receiving surgical treatment,and a telephone interview was conducted for survival information.Bcl-2 gene amplification and protein expression in tumor tissue were determined by fluorescenceinsituhybridization and immuno-histochemistry,respectively,and relationships between Bcl-2 and clinicopathological characteristics,immunophenotype and prognosis of PGI-DLBCL were analyzed.Results:Among 136 PGI-DLBCL patients,33 (24.3%) showing gene amplification and 90 (66.2%) showing protein expression of Bcl-2;gene amplification was correlated with primary tumor location,Ann Arbor stage,serum lactate dehydrogenase level,B symptom and International Prognostic Index (IPI) score (P<0.05),while protein expression was correlated with primary tumor location and immunophenotype (P<0.05).5-year overall survival (OS) in patients positive for Bcl-2 gene amplification and patients with non-GCB immunophenotype and positive for Bcl-2 protein expression were inferior to those negative ones (41.5%vs.71.5%,P<0.05;54.6%vs.84.6%,P<0.05).In Bcl-2 gene amplification or protein expression positive patients,5-year OS of CHOP chemotherapy was inferior to that of rituximab combined with CHOP chemotherapy (48.6%vs.80.3%,P<0.05;66.4%vs.83.4%,P<0.05).Conclusions:Detection of Bcl-2 gene amplification is useful for prediction of prognosis in PGI-DLBCL.Both patients with Bcl-2 gene amplification and non-GCB patients with Bcl-2 protein expression have a poorer prognosis.Rituximab may improve the prognosis in patients with Bcl-2 gene amplification or protein expression.