长链非编码RNA在放射治疗中的研究进展

周宇杰，徐细明

·综述·

长链非编码RNA在放射治疗中的研究进展

周宇杰，徐细明

长链非编码RNA；放射治疗；恶性肿瘤

长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是长度大于200个核苷酸且不具有蛋白质编码功能的RNA。研究表明，在多种恶性肿瘤放射治疗(放疗)前后，细胞中部分lncRNA异常表达，可能参与恶性肿瘤的发生、发展、转移等过程，通过介导特定的信号通路或调控细胞周期来影响恶性肿瘤细胞的放疗敏感性。本文结合国内外最新研究成果，就lncRNA在放疗中的研究进展做一综述。

1 lncRNA与恶性肿瘤

lncRNA的一级结构与核苷酸的排列顺序相似，曾误认为是转录过程中的“噪音”。近年研究证实lncRNA在基因组广泛转录，且长度大于200个核苷酸，无开放阅读框[1]。lncRNA通过多种方式对靶基因转录、翻译进行直接调控，或对靶基因上游或下游基因实现间接调控[2]。lncRNA参与基因印记、基因重组、染色质修饰、细胞周期调控及转录、翻译等多种细胞生命活动。目前研究认为lncRNA主要在表观遗传学、转录和转录后加工三个层面发挥对基因表达的调控作用[3-7]。在多种恶性肿瘤的发生、发展过程中，均伴随部分lncRNA的异常表达。人类肿瘤的lncRNA表达率先在乳腺癌中发现[8]，lncRNA HOX转录反义RNA(HOTAIR)在原发性乳腺癌和转移癌中表达增加，且在原发性肿瘤中的表达可预测肿瘤转移及预后情况。有研究表明，lncRNA-HULC在肝癌细胞中呈特异性高表达。Yang等[9]应用实时定量PCR检测胃癌组织lncRNA H19的表达水平，与正常对照组比较，其在胃癌组织和细胞中的表达水平显著升高，过量表达可促进细胞增殖，而siRNA干扰lncRNA H19表达可诱导胃癌细胞凋亡。

2 lncRNA与放疗

2.1恶性肿瘤放疗概况 放疗为恶性肿瘤常规治疗手段。最新数据显示1/3～1/2的肿瘤患者在疾病进程中需接受放疗。放疗的敏感性是影响恶性肿瘤治疗效果的关键，其作用靶点为DNA。DNA损伤后，细胞启动修复系统，对DNA损伤进行修复，在一定程度上造成了放疗敏感性降低、放疗抵抗，从而影响治疗效果。对于敏感性高的恶性肿瘤放疗效果佳，但并不是所有恶性肿瘤的放疗效果均很好，因肿瘤细胞对放疗不敏感导致部分患者不能从中获益。对于放疗抵抗，有学者认为与瘤内乏氧区域激活多种生物途径从而保护肿瘤细胞免受放疗辐射损伤有关[10-11]，或与DNA损伤和修复的基因突变有关[12-13]，或与激活细胞内促生存信号通路有关[14-16]，或与影响细胞周期调控或抑制细胞凋亡有关[17-18]。

DNA损伤应答涉及复杂的检测和修复损伤的网络，而lncRNA作为一种新的调控RNA，可能发挥重要作用。Wan等[19]研究证实，DNA损伤后通过毛细血管扩张性共济失调突变(ataxia-telangiectasia mutant， ATM)依赖方式促进转录因子E2F1的表达，进而促进lncRNA ANRIL转录上调，同时其表达水平受p53非依赖性调节，因此，提高lncRNA ANRIL的表达水平，进而抑制INK4a、INK4b和ARF在DNA损伤应答晚期的表达，使细胞在DNA修复完全时恢复正常。通过新制癌菌素(neocarzinostatin， NCS)造成DNA损伤，发现在DNA损伤应答过程中，lncRNA ANRIL能促进细胞增殖和DNA合成，抑制细胞凋亡及细胞周期检控点，致S期分布增加和G1期分布减少，推进细胞周期的进程，同时通过导入缺陷GFP，同源重组修复产生有功能GFP，且沉默ANRIL使同源重组修复减少50%，推测lncRNA ANRIL是同源重组修复途径所必需的。Zhang等[20]探讨与三阴乳腺癌密切相关的lncRNA LINP1表达，发现lncRNA LINP1像支架一样将Ku80和DNA-PKcs联系起来，对DNA双链断裂修复中非同源末端连接(Non Homologous End Joining， NHEJ)修复至关重要[21-24]，可增强NHEJ修复。当发生DNA双链断裂时，Ku80-Ku70异源二聚体将lncRNA LINP1招募到DNA损伤部位，而其能稳固Ku80和DNA-PKcs组成的复合体，从而增强DNA的NHEJ修复。激活的EGFR通过RAS-MEK-ERK信号通路和AP1转录，上调LINP1的表达，增强NHEJ修复，而p53通过miR-29靶向下调LINP1的表达，但反馈调节较慢，推测该负反馈调节机制限制NHEJ修复主要发生于DNA损伤后较长时间。Sharma等[25]研究发现lncRNA DDSR1在DNA损伤时以ATM-NF-κB依赖的方式诱导产生，该研究探索lncRNA DDSR1与同源重组修复之间的关系，发现通过增加BRCA1和RAP80募集下调DDSR1的表达，致同源重组修复减少，而在DNA双链断裂早期，BRCA1的募集可促进同源重组修复，但BRCA1和RAP80结合形成的复合体可通过抑制DNA双链断裂的末端切除限制同源末端修复[26-28]，进一步表明DDSR1和hnRNPUL1共同将BRCA1和RAP80募集到DNA双链断裂处以调控同源重组修复。

DNA损伤应答是一个重要的抗肿瘤障碍，其能维持基因组完整性，对抗紫外线、电离辐射、放化疗、致瘤性损伤及包括活性氧在内的内在和外在基因毒性损伤。鉴于上述研究基础，推测lncRNA在影响细胞放疗敏感性方面同样发挥着重要的调控作用。

2.2lncRNA与食管癌放疗 达春丽[29]研究表明，lncRNA HOTAIR及其靶因子Snail、β-catenin表达水平的升高及E-cadherin表达水平的降低在食管癌的放疗抵抗及侵袭、转移过程中发挥重要作用。lncRNA HOTAIR在不同细胞系其表达水平不同，在表达水平相对低的Eca109细胞株中，HOTAIR及EMT相关因子Snail、β-catenin表达亦降低，而E-cadherin表达水平高，且该细胞系的D0、Dq及SF2表达水平和细胞存活曲线各剂量点均显著低于其他细胞，说明该细胞系的放疗抵抗较其他细胞系低。该研究通过分次辐射诱导建立放疗抵抗细胞株Eca109R60/2，发现HOTAIR在放疗抵抗细胞株Eca109R60/2中表达水平显著高于Eca109(P=0.0306)，同时Eca109R60/2细胞株中EMT相关因子Snail、β-catenin的mRNA和蛋白质水平均显著高于Eca109，而E-cadherin在Eca109R60/2细胞内表达水平显著降低。

Zhang等[30]研究发现WISP1通过抑制放疗诱导的DNA损伤和激活PI3K激酶，导致放疗抵抗，且动物实验显示，放疗联合重组WISP1注射组裸鼠移植瘤重量较单纯放疗组移植瘤重量大(P=0.0298)，且通过检测WISP1过表达的KYSE-150细胞系在放疗前及6 Gy放疗辐射后30 min与肿瘤相关的lncRNA表达，发现lncRNA BOKAS与放疗诱导WISP1表达上调密切相关。通过细胞内转染siRNA下调BOKAS的表达，WISP1表达量从351.09 pg/ml降至99.3578 pg/ml，之后行6 Gy放疗辐射，30 min后检测WISP1表达量轻度增加(从99.3578 pg/ml增至116.14 pg/ml)，推测WISP1通过抑制细胞色素c和Bcl-xl的表达抑制放疗辐射后细胞凋亡，同时抑制放疗辐射诱导的γ-H2AX表达，且lncRNA BOKAS在放疗后表达上调并促进WISP1的表达，致放疗抵抗。Tong等[31]研究证实lncRNA LOC285194的低表达与食管鳞癌放化疗抵抗密切相关。Zhou等[32]研究发现，lncRNA AFAP-AS1的过量表达与食管鳞癌的放疗抵抗相关。

2.3lncRNA与鼻咽癌放疗 Wang等[33]发现放疗诱导的鼻咽癌细胞lncRNA的差异表达可被姜黄素逆转，单纯放疗组lncRNA AK294004表达上调(2.88-fold)，放疗联合姜黄素组lncRNA AK294004表达下调(1.21-fold)，证实lncRNA对放疗诱导的放疗抵抗具有重要作用。lncRNA AK294004通过部分外显子对细胞周期蛋白D1(CCND1)进行负反馈调节，导致CCND1在放疗诱导的DNA损伤中表达下调，且其是细胞周期和DNA修复的重要分子[34]。Jin等[35]研究发现，lncRNA MALAT1通过靶向下调miRNA-1的表达同时上调slug水平，而slug的过量表达能逆转由MALAT1表达下调引起的肿瘤干细胞抑制及增加放疗敏感性，同时向细胞转染sh-MALAT1后，行梯度放疗辐射，绘制细胞存活曲线，结果显示，sh-MALAT组细胞存活曲线明显低于空质粒组，且细胞凋亡增加，亦证实了MALAT1表达下调使放疗敏感性增加。当裸鼠移植瘤直径达5 mm，行连续5 d、每日2 Gy的放疗辐射，发现lncRNA MALAT1表达下调组肿瘤组织较对照组明显缩小，证实了slug通过调控肿瘤干细胞的激活进而调控肿瘤细胞的放疗敏感性，推测lncRNA MALAT1通过调控slug的表达从而调控肿瘤干细胞的激活和增加鼻咽癌细胞放疗抵抗[35]。

2.4lncRNA与宫颈癌放疗 Jing等[36]研究发现lncRNA HOTAIR过表达能预测宫颈癌的放疗抵抗(P<0.0001)，且HOTAIR过表达与p21水平呈负相关(P<0.0001)。在Hela细胞系中，下调HOAIR表达可促进p21的表达，反之，在C33A细胞系中，上调HOTAIR表达可显著抑制p21的表达。上述研究显示，下调HOTAIR的表达可增加细胞G1期分布，使细胞存活曲线下移，显著增加Hela细胞的放疗敏感性，但这种效应能被p21抑制剂所抑制。与母代细胞相比，HOTAIR过表达的C33A细胞S期分布增加，对放疗辐射的抵抗更强，细胞存活曲线较空质粒组上移，然而上调p21表达后，细胞存活曲线较前下降，细胞凋亡增加，且对放疗辐射敏感性增加。动物实验证实，下调HOTAIR的表达能抑制肿瘤生长并增加肿瘤放疗敏感性，将移植瘤行免疫组织化学染色，结果显示，当下调HOTAIR表达后，Ki-67表达下调及p21表达上调，且在下调HOTAIR和放疗结合时更明显。推测HOTAIR通过下调p21的表达诱导放疗抵抗，同时上述效应能被上调p21的表达所逆转。

Lu等[37]研究发现lncRNA MALAT1通过调控细胞周期以改变高危型人乳头瘤病毒感染的宫颈癌细胞的放疗敏感性，可能通过转录后水平负性调控miR-145表达。在宫颈癌细胞接受放疗辐射后，lncRNA MALAT1的表达上调而miR-145表达下调，转染siRNA下调lncRNA MALAT1表达后，CaSki和Hela细胞放疗辐射后克隆形成率降低，且细胞G1期分布减少，G2/M期分布增加，这种细胞分布改变与是否接受放疗辐射无关。有研究表明，抑制内生性MALAT1的表达能降低细胞周期调控分子cyclinD1、cyclinE及CDK6的表达，推测lncRNA MALAT1对放疗敏感性的影响与细胞周期调控有关，而miR-145发挥抑瘤作用亦可能与调控细胞周期调控分子CDK6、CDK2和Cyclin D1有关[38]。通过RNA结合蛋白免疫沉淀测定(RNA-binding protein immunoprecipitation assay， RIP)和RNA蛋白质体外结合实验(RNA pulldown assay)，证实MALAT1和miR-145在RNA诱导的沉默复合体(RISC)中有双向作用，lncRNA MALAT1表达下调而miR-145表达上调较单纯miR-145表达上调对放疗敏感性的增强作用更明显[37]。推测MALAT1-miR-145轴能调控高危型人乳头瘤病毒感染的宫颈癌细胞的放疗敏感性。

2.5lncRNA与结直肠癌放疗 Wang等[39]研究发现lncRNA-p21可能通过促进细胞凋亡来增加结直肠癌细胞的放疗敏感性，且X线照射后SW116和LOVO细胞系中lncRNA-p21的表达增加，而lncRNA-p21过表达的细胞及对照组细胞均接受X线照射，发现过表达组细胞凋亡率为25%，对照组仅为10%。在结直肠癌细胞和组织中lncRNA-p21与β-catenin表达呈负相关，在SW116细胞系中lncRNA-p21过表达显著抑制了β-catenin在mRNA和蛋白质中的表达，在X线照射后细胞株中β-catenin表达量下降，说明lncRNA-p21调控结直肠癌细胞放疗敏感性可能与lncRNA-p21抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。lncRNA-p21可促进促凋亡基因Noxa表达，X线照射后lncRNA-p21表达水平升高，继发性引起促凋亡基因Noxa表达增加，可能为lncRNA-p21增加结直肠癌放疗敏感性的分子作用机制。

2.6lncRNA与其他细胞模型的放疗 Jiao等[40]研究发现lncRNA LIRR1过表达显著增加了放疗辐射后人支气管上皮细胞系BEAS-2B的放疗敏感性，致G1期阻滞及γ-H2AX焦点形成增加，同时还可导致放疗辐射后DNA双链断裂的感受器KU70、KU80和DNA损伤修复蛋白RAD50及细胞周期G1期检测点CDK2表达下调、p53显著激活、p21显著诱导、鼠双微体2(MDM2)的表达下降。随后用Pifithrin-α抑制p53的表达，发现鼠MDM2表达量增加，为细胞周期分布和DNA损伤的关键初始反应。推测lncRNA LIRR1通过p53依赖性方式调控DNA损伤应答的信号通路。

Ding等[41]通过对人类皮肤模型的低剂量放疗辐射的研究，发现两种lncRNA，即ITPK1-AS1和LINC00467在共表达网络中作用显著，可能在低剂量放疗辐射中起作用。

3 展望

近年研究证实，lncRNA在多种恶性肿瘤的发生、发展中发挥着重要作用[42]。目前lncRNA在放疗中的研究仍处于初始阶段，具体的分子生物学机制尚未完全清楚。随着lncRNA在放疗中的相关作用研究不断深入，将发现更多关于lncRNA调控恶性肿瘤放疗敏感性及放疗抵抗的具体机制，为恶性肿瘤的放疗提供新的治疗思路。

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R94.32

A

1002-3429(2017)09-0106-05

10.3969/j.issn.1002-3429.2017.09.037

2017-04-20 修回时间：2017-05-24)

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