102例肺腺癌常见基因突变与中医证型关系的研究❋

王 君，徐 力

(南京中医药大学 第一临床医学院， 南京 210023)

肺癌作为全球癌症的第一大杀手，严重影响患者的健康及生存质量，肺癌同样居我国癌症发病率首位，其中肺腺癌占非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的50%左右。肺腺癌作为非小细胞肺癌中的重要亚型,其分子分型对指导预后判断及个体化治疗具有重要意义，其中较为常见的为表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、Kirsten鼠肉瘤病毒基因(Kirsten rat sarcoma,KRAS)、棘皮动物微管相关类蛋白4(echinoderm microtubule associated protein like4, EML4) 与间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK) 融合基因 EML4-ALK。虽有大量研究文献对肺腺癌的中医证型进行报道，但肺腺癌的基因变异类型与中医证型之间关联性的研究甚少。本文就二者的相关性进行探讨，为从分子机制角度更深层次地认识肺腺癌的中医证型本质提供参考。

1 临床资料

1.1 纳入和排除标准

经病理学或细胞学确诊的原发性肺腺癌；已行上述基因检测的肺腺癌患者；已确诊有上述基因变异之一的肺腺癌患者；年龄大于18岁；未经任何治疗的原始初诊患者。排除标准：非上述3种单基因突变患者；合并其他肿瘤的患者；严重心肝肾疾病和功能障碍患者。

1.2 诊断标准

1.2.1 西医诊断标准 患者临床病理类型及分期采用《中国原发性肺癌诊疗规范(2015版)》[1]与《NCCN肺癌筛查指南(2016V2)》标准；通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)及DNA直接测序法检测EGFR外显子18-21突变类型、KRAS 外显子2、3突变类型，荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)检测EML4-ALK融合基因。

1.3.2 中医证型辨证标准 本研究参考《中药新药治疗原发性支气管肺癌临床指导原则》(试行)[2]，以及收集患者症状表现，经组内探讨分析后，决定把肺腺癌患者中医证型分为5型，气虚痰湿证：胸闷气短，咳嗽，咳白色黏稠痰，纳呆便溏，苔白腻，脉弦滑;阴虚内热证：咳嗽少痰，心烦口干，胸痛气急，潮热盗汗，舌红少津，脉细数；气阴两虚证：咳嗽少痰，痰稀而黏，咳声低微，气短喘促，神疲乏力，心烦盗汗，口干少饮，舌红苔薄白或薄黄，脉细弱；气滞血瘀证：咳嗽咯痰不爽,咳嗽带血,胸闷胸痛如刺,痛有定处,大便秘结,唇甲紫暗,舌质暗或瘀斑；热毒炽盛证：咳嗽、咳黄色黏稠痰，胸痛，口干鼻燥，口渴欲饮，发热，脉数，苔黄。

1.4 资料来源

收集2016年5月至2016年11月在南京止马营等8个社区240例肺癌患者病例资料，所有患者的石蜡包埋组织标本切片均经苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，HE染色法)，并经江苏省中医院病理科诊断确诊为肺腺癌，其中符合纳入标准患者为102例，女性52例，男性50例，平均年龄(58±8.3)岁，年龄范围为37～78岁。根据TNM分期Ⅰ期患者23例,Ⅱ期28例,Ⅲ期27例,Ⅳ期24例。

2 研究方法

2.1 基因检测方法

2.1.1 试剂及设备 DNA提取试剂盒DEXPAT、Taq酶购自宝生物工程(大连)有限公司，基因扩增PCR仪为美国ABI 9700，DNA测序仪为美国ABI 3730xl，ALK双色分离探针试剂盒购自北京金菩嘉医疗科技有限公司，荧光显微镜为日本Olympus BX51产品。

2.1.2 DNA提取及定量 用二甲苯脱蜡及无水乙醇脱水处理患者石蜡包埋组织切片，采用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，所有步骤按照试剂说明书操作，将3～5片10 μm的切片置于Eppendorf管中，加10滴DNA抽提液充分混匀，100 ℃下加热10 min，13000 r/pm离心10 min，DNA提取后使用紫外分光度计检测浓度，然后用0.8%琼脂糖凝胶电泳测定DNA质量。

2.1.3 EGFR、KRAS突变检测 表1显示，使用PCR及DNA测序法检测EGFR基因18～21号外显子突变以及KRAS 2、3号外显子突变。引物设计及合成：EGFR 18-21外显子与KRAS 外显子2、3外显子引物序列均由上海生工生物工程有限公司设计合成。PCR反应条件: 94 ℃，5 min(95 ℃，30 s，60 ℃，45 s， 72 ℃，60 s)×40 个循环；72 ℃，10 min；PCR 反应体系：10×buffer，dNTP mix，MgCl2，正向引物25pmol，反向引物25 pmol，Platinum Taq 酶和 DNA 模版50ng。所有PCR扩增产物经1.2%琼脂糖电泳后送至南京世和基因生物有限公司进行测序。运用CIROMAS软件分析结果，并与基因库中正常EGFR基因序列和正常KRAS序列进行比较。

2.1.4 EML4-ALK融合基因检测 使用ALK双色分离探针试剂盒进行检测，探针区域在2p21～2p23。根据试剂盒说明书进行操作，具体步骤：4～5μm石蜡切片56℃烤片3 min，常规脱蜡，滴加胃蛋白酶预处理液消化15 min； 2×SSC漂洗5 min固定，每个切片滴加ALK探针10 μL，覆盖杂交盖片78 ℃变性8 min，保持42℃杂交过夜，杂交后先浸入0.4×SSC/0.3%NP-40洗涤液洗涤1.5 min， 后浸入2×SSC/0.1%NP-40洗涤液洗涤0.5 min，再使用70%乙醇洗涤5 min，干燥后加入适量DAPI复染剂至杂交区域，用荧光显微镜观察。结果判读：ALK阳性标准：任何着色细胞内存在细胞胞质内有强染色颗粒即可判定为阳性。ALK重排为肿瘤细胞胞质内红色和绿色信号分离，间距≥2个信号直径或单一红色信号。ALK无重排为肿瘤细胞内红色和绿色信号黏合或出现黄色信号。FISH 阳性检测标准: ALK阳性是计数为50个观察细胞中存在>25阳性细胞，即可直接判定为ALK阳性，若存在5～25个阳性细胞需再计数50个肿瘤细胞，100个观察细胞总存在≥15个阳性细胞，可判定为ALK阳性。

表1 EGFR与KRAS基因扩增引物

2.2 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析，中医证型、基因突变类型采用构成比，病期与中医证型相关性、基因变异与中医证型相关性采用卡方检验，P<0.05，P<0.01为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 基因检测结果

3.1.1 EGFR、KRAS的PCR法检测结果 图1、2显示，在送检的102例肺腺癌石蜡包埋切片中，EGFR突变共73例，共发生在外显子19(38例)、20(23例)、21(12例)，18无外显子突变。外显子19突变共包括del-E746-A750缺失突变(32例)和del-L747-P753insS突变(6例)。外显子20突变是T790 M突变，外显子21是 L858R突变，KRAS 突变有12例,其中均是2外显子G12C突变。

3.1.2 EML4-ALK融合基因FISH检测结果 图3显示，在送检的102例肺腺癌石蜡包埋切片中，ALK双色分离探针试剂共检出14 例强阳性，3例可疑阳性，85例阴性。

图1 EGFR 扩增产物电泳条带注：Lane1：外显子18(394 bp)；Lane2：外显子19(394 bp)；Lane3：外显子20(283 bp)；Lane4：外显子21(297 bp)； M:maker

图2 KRAS扩增产物电泳条带注：Lane1：外显子2(353 bp)；Lane2：外显子3(294 bp)；M:maker

图3 双色分离 FISH 探针检测 EML4-ALK 融合基因注：ALK阳性肺腺癌患者FISH检测出肿瘤细胞胞质出现红绿信号分离或者额外的红色信号(箭头示)，提示存在EML4-ALK 融合基因

3.2 统计结果

3.2.1 102例肺腺癌中医证型构成 表1显示，肺腺癌下各中医证型之间比较差异有统计学意义(χ2=18.294,P=0.001<0.01)，其中肺腺癌以气阴两虚表现为主。

表1 102例肺腺癌中医证型构成比较[例(%)]

3.2.2 102例肺腺癌基因突变类型构成 表2显示，肺腺癌下各基因突变类型之间比较差异有统计学意义(χ2=88.065，P=0.000<0.01)，其中以EGFR突变型为主。

3.2.3 102例肺腺癌中医证型与基因变异之间相关性比较 表3显示，各组3种基因突变之间经统计学比较,EGFR基因突变下肺腺癌中医证型之间比较差异有统计学意义(χ2=31.863，P=0.000<0.05)，其中以气阴两虚证表达为主；EML4-ALK突变下与KRAS突变下证型比较差异无统计学意义(χ2=4.471，P=0.346>0.05，χ2=6.333，P=0.176>0.05)；3种基因突变下的证型之间比较差异有统计学意义(χ2=20.666，P=0.008<0.05)；两两比较，EGFR与EML4-ALK变异下证型比较差异有统计学意义(χ2=11.546，P=0.021<0.05)，EGFR与KRAS基因突变组间中医证型比较差异有统计学意义(χ2=11.869，P=0.018<0.05)，EML4-ALK与KRAS基因突变组间中医证型比较差异无统计学意义(χ2=1.212，P=0.876>0.05)。

表2 102例肺腺癌基因突变类型构成比较[例(%)]

表3 102例肺腺癌中医证型与基因变异之间相关性比较(%)

3.2.4 102例肺腺癌中医证型与临床分期相关性比较 表4显示，经卡方检验后各分期之间中医证型比较差异有统计学意义(χ2=61.101，P=0.000<0.05)，其中气阴两虚证以Ⅲ期、Ⅳ期为主。

表4 102例肺腺癌中医证型与临床分期之间相关性比较[例(%)]

4 讨论

中医认为肺癌发病机制以正虚为本，首先是正气不足，无力抵御毒邪导致毒瘤内生[3]；其次脏腑受损，气血津液运行不畅，外邪侵袭，癌毒内生，导致疾病的发生。本研究Ⅰ、Ⅱ期患者以气滞血瘀证和气虚痰湿证为主，Ⅲ、Ⅳ期患者以气阴两虚证为主，肺癌患者早期邪实正不虚、正邪相争表现为实证。又因本研究入组患者多居南方，天气潮湿，湿邪困脾，久生痰湿，气虚导致气血运行不畅久致血瘀，故常表现为气滞血瘀证和气虚痰湿证，疾病由浅及深，机体无力抵抗外邪，病证由实至虚，中晚期多表现为虚证。《周氏医学丛书·脏腑标本药式》[4]指出：“肺藏魄，属金，总摄一身之气。”肺主气，肺脏受损呼吸功能定会受到损失，不仅影响宗气的生成，也影响一身之气的盛衰，易导致气虚，故肺癌患者常常表现为气短、乏力等症状。肺为娇脏，喜润恶燥，邪热耗津常表现为肺阴不足。肺癌发病以正虚为本，其中常见气阴两虚，中晚期患者因病情发展，或因化放疗等各种治疗手段导致恶心呕吐等消化道反应，更易耗气伤阴。本研究可知，肺腺癌中EGFR突变型较为常见，EGFR基因突变下肺腺癌中医证型之间比较差异有统计学意义，其中以气阴两虚证表达为主，中晚期肺腺癌患者也常表现为气阴两虚证的虚证。

EGFR是上皮生长因子(EGVF)细胞增殖和信号传导受体，能与表皮细胞生长因子(EGF)及 转化生长因子-α(TGF-α)有效结合，从而激活受体酪氨酸激酶,使受体本身及细胞内酪氨酸残基磷酸化, 从而引起细胞的异常分裂增殖[5]。在EGFR基因调节作用失控情况下[6]，通过相应的信号通路，调控肿瘤细胞的恶性增殖、周围血管生成、肿瘤侵袭转移。中晚期以虚证为主兼并实证，气虚使血行不畅，阴虚使邪热内生、津液损耗，机体内环境发生改变。如血液高黏状态、免疫调节功能受损，促进肿瘤亢进的生长因子，破坏因子间的平衡，促使肿瘤细胞与基质成分的黏附、肿瘤血管的生长以及增强肿瘤细胞相关信号通路，更加增强了EGFR基因及相关基因的高表达，导致肿瘤细胞的增殖，故肺腺癌EGFR基因突变型治疗应重视补肺养阴和益气健脾。

既往研究可知，益气养阴法可以抑制肿瘤的增殖、侵袭、转移。胡小勤[7]认为益气养阴方生脉散能够降低人工基底膜种植体内的内皮细胞迁移数，起到抗肺癌肿瘤细胞血管生成的作用。李春杰[8]发现，益气养阴组方(黄芪、白术、天冬、茯苓、白花蛇舌草等) 能够明显降低C57BL/6小鼠 Lewis 肺癌中金属角蛋白酶-9(MMP-9)及其抑制物(TIMP-1)水平，抑制肺癌的转移。肺积方[9]能促进肿瘤坏死因子-α(TNF-α)分泌，抑制 EGFR表达，从而抑制Lewis肺癌肿瘤细胞增殖与转移。邹银水[10]认为，益气养阴方可以显著改善气阴两虚证患者的生存质量及免疫功能。然而本研究由于纳入样本量偏小，此结论仍需大样本、多中心研究证实。

综上所述，肺腺癌的EGFR突变型患者以气阴两虚为主，且益气养阴法可以抑制肿瘤细胞的增殖转移，提示基因突变检测结果有望成为未来中医药辨证治疗肺癌的参考指标之一，对阐明中医药辨证肺癌的机制具有重要的科学价值。

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[4] 周学海.周氏医学丛书·脏腑标本药式[M].福慧双修馆藏版影印本，1936.

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[8] 李春杰，孙建立，刘苓霜，等. 益气养阴方抗 C57 小鼠 Lewis 肺癌转移作用与调节MMP-9、 TIMP-1蛋白表达的实验研究 [J].上海中医药杂志，2009，43(6):63-67.

[9] 陈学彰，田华琴，黄志庆，等. 肺积方对Lewis肺癌小鼠抑瘤率及EGFR、TNF-α表达的实验研究 [J].中西医研究，2013，5(1):17-20.

[10] 邹银水. 益气养阴方对行化学治疗的非小细胞肺癌气阴两虚证患者免疫功能及生活质量的影响 [J].新乡医学院学报，2015，32(6):546-548.