银杏内酯B对阿尔茨海默病大鼠海马Synapsin-1、Beclin1 和LC3表达的影响❋

田新红，郝 莉，游言文，徐玉英，于世奇

(河南中医药大学基础医学院,郑州 450008)

学习记忆障碍是阿尔茨海默病(alzheimer’s disease, AD)的主要临床表现，β淀粉样蛋白(amyliod-βprotein, Aβ)沉积形成老年斑、神经纤维缠结、突触丢失是AD的主要病理学改变，其中Aβ引起的突触丢失是AD学习记忆障碍的主要原因[1-2]。突触蛋白1(Synapsin-1)是一种与突触结构、功能密切相关的膜蛋白。自噬又称为Ⅱ型细胞死亡，是细胞在自噬相关基因(autophagyrelated gene，Atg)调控下利用溶酶体降解自身受损细胞器和大分子物质的过程。自噬相关基因1(Beclin1)和微管相关蛋白轻链3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3) 是哺乳动物细胞自噬的主要相关基因。已有研究证实，AD患者与动物模型大脑自噬水平上调类同[3]，自噬是突触丢失的主要方式[4-5]。

中药银杏叶提取物可改善AD相关学习记忆力下降,而银杏内酯B(Ginkgobalide B,GB)是银杏叶提取物的主要活性成分，具有保护神经元、促进学习和改善记忆的作用[6]。实验证实，GB可改善AD相关的学习记忆缺陷[7]，然而其具体作用机制尚未阐明。 本研究建立Aβ1-42诱导的AD大鼠模型，腹腔注射中药单体GB，从行为学和分子生物学角度探讨GB改善AD相关学习记忆能力下降及突触相关蛋白Synapsin-1、自噬相关基因Beclin1和LC3在其中的作用，为中药单体防治AD提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂仪器

雄性清洁级 Sprague-Dawley(SD)大鼠，体质量180～220 g，由河南实验动物中心提供(合格证号SCXK (豫)2010-0002)。GB购自中国食品药品检定研究院；Aβ1-42购自Sigma公司；兔单克隆一抗Synapsin-1、Beclin1和LC3购自Cell Signaling公司；辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗购自北京中杉金桥公司；Tecnai-12透射电镜购自飞利浦公司；莱卡显微成像系统购自莱尔公司；全自动凝胶成像系统购自天能公司；VCX130 超声破碎仪购自美国Sonics 公司；Stepone 实时荧光定量PCR仪购自美国Applied Biosystems公司。

1.2 方法

1.2.1 AD动物模型建立 SD大鼠使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，头固定于脑立体定位仪上，参考大鼠脑立体定位图谱：正中做一切口暴露出前囟，以前囟为原点向后4 mm，旁开2.5 mm 左右各钻一孔，硬脑膜下3 mm至两侧海马。由微量注射器将2 μL(10μg)Aβ1-42在10 min内注射完毕，留针10 min，使得Aβ1-42充分浸润局部组织，术后均注射抗生素防止感染。假手术组大鼠注射等量生理盐水。

1.2.2 分组及治疗 将SD大鼠按随机数字表法分为假手术组(8只)、模型组(8只)、GB低剂量组(15只)、中剂量组(15只)5组和高剂量组(15只)。模型造成3 d后，GB低、中、高剂量组腹腔注射GB，剂量分别为每天2.5、5和7.5 mg/kg，假手术组和模型组给予等量生理盐水，均为15 d。

1.2.3 Morris水迷宫检测学习记忆能力 测试期间室内保持安静，水池内注入清水并加入墨汁至水不透明，水面高出平台2 cm。第1天进行预实验让大鼠适应环境，同时将其引导到平台。其后4 d，大鼠每日从不同入水点放入水中， 找到平台时间即逃避潜伏期，逃避潜伏期记录为60 s。第6天撤除平台，将大鼠从任一处放入水池，测试60 s内穿越原平台位置的次数。行为学检测期间仍对大鼠进行GB治疗。

1.2.4 透射电镜检测自噬 水迷宫实验结束后1 h，大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，打开胸腔暴露心脏，灌注生理盐水冲洗血管，灌注2.5%戊二醛固定。剥离鼠脑，取约1 cm3海马CA1区组织，置于戊二醛中固定并用磷酸漂洗，乙醇脱水、丙酮包埋，固化、切片、染色，透射电镜观察、拍片。

1.2.5 免疫组织化学检测Synapsin-1、Beclin1和LC3表达 灌注预冷的多聚甲醛进行固定。快速断头取脑，多聚甲醛固定24 h，乙醇梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋切片。脱蜡、修复、PBS清洗，血清封闭，37 ℃孵育20 min；滴加一抗(兔抗Synapsin-1、Beclin1和LC3，稀释1∶200)，37 ℃孵育过夜；加HRP标记二抗，孵育、DAB显色，中性树胶封片。选取海马CA1区不重叠的5个高倍视野，计算其阳性光密度值。

1.2.6 荧光定量PCR检测海马组织Synapsin-1、Beclin1和LC3-Ⅱ mRNA表达 按照Trizol试剂盒说明书从冰冻海马组织中快速提取总RNA并逆转录成 cDNA。Synapsin-1上游引物：5′-CTGGACTGCGGTATTGAGAC-3′，下游引物：5′-CCGGGTGCGGTAGAGTAAGC-3′；Beclin1上游引物：5′-GTTCTCTCAGTTGCCTTTC-3′，下游引物：5′-AGCTGTAACCTGTCGCCGAGTCCC-3′；LC3-Ⅱ上游引物：5′-CGGGTTGAGGAGACACACAA-3′，下游引物：5′-ATGAGCCGGACATCTTCCAC-3′；GAPDH上游引物：5′-CTACCCACGGCAAGTTCAAT-3′，下游引物：5′-GGATGCAGGGATGATGTTCT-3′，均由上海生工生物有限公司合成。按照试剂盒说明书进行扩增,PCR反应总体积为25 μL,反应条件：95 ℃ 预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s,35个循环；72 ℃延伸10 min。由系统软件自动生成循环域值(Ct)。每个样品均做3个平行孔，取平均值作为该样品的Ct值,并计算出Synapsin-1、Beclin1和LC3-Ⅱ相对表达量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠 Morris 水迷宫结果

表1显示，与假手术组比较，模型组大鼠的平均逃避潜伏期延长(P<0.05),去掉平台后模型组穿越原平台次数明显减少(P<0.01)；腹腔注射银杏内酯B 15 d后，中、高剂量组平均逃避潜伏期时间缩短(P<0.05),穿越原平台次数增加(P<0.05),行为学结果提示GB具有改善 AD 大鼠学习记忆下降的能力。

表1 各组大鼠 Morris水迷宫实验结果比较

注：与假手术组比较:1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较:3)P<0.05，4)P<0.01

2.2 各组大鼠海马CA1区神经元电镜观察自噬结果

图1显示，与假手术组比较，模型组大鼠电镜自噬体结构较明显。随着GB治疗剂量的增加 ，可观察到自噬体结构逐渐不明显。

图1 各组大鼠海马CA1区神经元自噬电镜观察结果(20000×)注：▲代表自噬体

2.3 各组大鼠海马CA1区Synapsin-1、Beclin1和LC3蛋白和mRNA表达

图2表2显示， Synapsin-1的阳性表达部位主要在细胞核周围的细胞质中，呈深黄色或褐色，细胞核呈蓝色。与假手术组比较，模型组大鼠海马CA1区Synapsin-1蛋白表达降低(P<0.05)呈弱阳性。随着腹腔注射GB剂量的增加，Synapsin-1蛋白表达逐渐上升呈强阳性，其中GB高剂量组作用最强(P<0.05)。 LC3和Beclin-1主要定位于海马神经元细胞质中，阳性表达呈棕色。假手术组仅有少量阳性细胞，且着色浅淡；模型组中LC3和Beclin-1胞质的染色程度加深，阳性细胞数明显增多(P<0.05)。与模型组比较，随着腹腔注射GB剂量的增加，Beclin-1的表达程度及阳性细胞数逐渐减少(P<0.05)，而LC3有降低的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，提示GB具有提高 AD大鼠海马CA1区Synapsin-1，降低Beclin-1蛋白表达的能力(图中箭头分别表示阳性细胞)。

图2 各组大鼠海马CA1区免疫组化Synapsin-1、Beclin1和LC3蛋白表达(400×)

表2显示，与假手术组比较，模型组大鼠海马组织Synapsin-1 mRNA水平下降(P<0.01)，Beclin1和LC3-Ⅱ mRNA水平表达升高(P<0.05)；与模型组比较，GB治疗中、高剂量组Synapsin-1和Beclin1 mRNA相对表达量分别增加和降低(P<0.05)；与模型组比较，GB治疗中剂量组LC3-ⅡmRNA表达量有降低趋势(P>0.05)，高剂量组表达量明显降低(P<0.05)。

表2 各组大鼠海马CA1区Synapsin-1、Beclin1和LC3蛋白和mRNA表达

注：与假手术组比较:1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较:3)P<0.05，4)P<0.01

3 讨论

本研究选择使用Aβ1-42硬脑膜下注射大鼠两侧海马建立AD动物模型。学习记忆障碍是AD的主要临床表现，Morris水迷宫是检测学习记忆能力的主要行为学方法。它通过让受试动物在水环境中寻找隐匿平台，并分析其找到平台所需时间(逃避潜伏期)及动物穿越隐匿平台的次数来判断空间学习记忆能力。本研究通过Morris水迷宫检测AD动物模型的学习记忆能力，结果与正常组比较，AD模型组大鼠平均逃避潜伏期明显延长，去除平台后模型组穿越原平台的次数减少，说明Aβ1-42建立的大鼠模型学习记忆能力下降，提示AD动物造模成功，可被用于后续的实验。

Morris水迷宫中逃避潜伏期越短、穿越隐匿平台的次数越多，表明受试动物的空间学习记忆能力越好。本研究在Morris水迷宫行为学检测时观察到，与AD模型组比较，随着腹腔注射GB剂量的增加，治疗组大鼠逃避潜伏期时间缩短，穿越原平台次数明显增加，提示中、高剂量即5和7.5 mg/kg的中药单体GB具有改善AD大鼠学习记忆下降的能力。

已有研究证实，AD病人和动物模型脑中均存在突触丢失[8-9]，且突触丢失较神经元数量减少更显著。突触丢失是AD的一个主要病理学特征，是学习记忆障碍的结构基础[10-11]。促进突触丢失的主要原因，是病理情况下β淀粉样前体蛋白(amyliod precursor protein,APP)被2种分泌酶切割产生Aβ，主要是由39～43个氨基酸组成的Aβ40和Aβ422种分子，其中Aβ42比Aβ40疏水性强，易聚集、 易导致AD老年斑块的形成[12]。Aβ是AD最主要的突触毒素,可破坏海马脑片或动物的长时程增强,降低树突棘密度影响学习记忆[13]。Synapsin-1是进化中高度保守的蛋白质，定位于突触囊泡膜上，是一种与突触结构和功能密切相关的特征性膜蛋白，其数量和分布密度可间接反映突触的密度。AD小鼠模型中，SynapsinⅠ表达水平明显降低。海马是参与学习记忆功能的重要结构，也是AD病人脑中最易受累的区域之一。本研究观察到，Aβ1-42建立的AD大鼠模型海马组织SynapsinⅠmRNA和蛋白表达下降与文献基本一致。使用中、高剂量的银杏内酯B可增加SynapsinⅠ水平。GB是银杏叶提取物的主要单体。本课题组前期实验发现，银杏叶提取物可改善衰老鼠学习记忆力下降[14-15]，且与其提高海马神经元SynapsinⅠ表达相关。AD是与衰老密切相关的疾病，学习记忆力下降是其主要临床症状。结合本研究观察到的结果提示，银杏叶提取物主要可能是通过其中的单体GB改善衰老相关的学习记忆，而这种改善可能与大鼠海马突触蛋白SynapsinⅠ表达水平增加有关。

本研究通过透射电镜观察各组大鼠海马CA1区神经元超微结构发现，模型组出现的自噬体大多位于细胞核旁，GB可减少细胞内自噬体数量。自噬与突触丢失相关，AD动物模型SAMP8小鼠的海马神经元突触丢失伴随LC3阳性细胞数的增加[5]。LC3 是酵母 Atg8 的哺乳动物同源体，是公认的哺乳动物细胞自噬标志物。免疫组化方法检测到AD模型大鼠海马LC3蛋白表达增加，与文献基本一致；而GB对LC3影响不明显差异无统计学意义。自噬发生时，pro-LC3 被加工成胞浆型LC3(即LC3-Ⅰ)。经自噬相关基因-5(autophagy related gene-5, ATG5) 和自噬相关基因-3(autophagy related gene-5, Atg3)催化，LC3-Ⅰ酶解掉一小段多肽，转变为一种膜结合形式即 LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ是由LC3-Ⅰ转化而来，LC3-Ⅱ的含量已被证实与自噬体形成有关。由于哺乳动物细胞内LC3-Ⅱ蛋白能够调控自噬体形成，其表达水平的高低在某种程度上可反映细胞自噬活性[16]。为进一步探讨银杏内酯B对LC3的影响，又检测了LC3- ⅡmRNA，结果显示中、高剂量GB可降低AD模型大鼠海马LC3-ⅡmRNA表达水平。Beclin1基因是酵母ATG6的同系物，调节启动自噬体的形成，也是哺乳动物细胞自噬的特异性基因。有学者发现，Beclin1在AD脑中的表达增加。本研究AD模型大鼠海马Beclin1 mRNA和蛋白表达升高，腹腔注射不同剂量的GB后，Beclin1表达水平下降。

临床上银杏叶提取物已被应用于缺血性心脑血管疾病的防治，GB是银杏叶提取物的主要有效成分之一。本研究观察到，GB可改善AD模型大鼠学习记忆力下降，提高突触相关蛋白SynapsinⅠ表达，这些作用可能与GB降低海马神经元自噬水平有

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