蛋氨酸灌胃制备高同型半胱氨酸血症大鼠模型研究

代 渊，魏江平，潘 婷，秦莉霞，王曙宾，徐世军△

(1. 成都中医药大学养生康复学院， 成都 611137； 2. 成都中医药大学药学院， 成都 611137；3. 北京斯利安药业有限公司, 北京 100176)

高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia, HHcy)是一种以血液中同型半胱氨酸(Homocysteine, Hcy)含量持续高于正常水平(5～15 μmol/L)为特征的疾病，它由遗传、环境因素、生活习惯和疾病状态等因素所致[1]。目前制备HHcy 模型的动物种系繁多且造模方式多样[2-3]。高浓度Hcy或蛋氨酸饮食(水)喂养是最常用的造模方法，但存在造模剂量不准确、原料浪费大、血清Hcy离散度大、模型不均一等不足。本研究通过参考文献报道，采用同浓度蛋氨酸溶液自由饮水法平行对照，筛选在不影响脂代谢条件下制备HHcy的最适宜蛋氨酸灌胃剂量。

1 材料

1.1 实验动物

21只SPF级雄性SD大鼠，体质量(200±20) g，四川省医学科学院、四川省人民医院实验动物研究所；20只SPF级雄性SD大鼠，体质量(200±20) g，成都达硕实验动物有限公司。

1.2 试剂与设备

L-蛋氨酸，山东西亚化学股份有限公司；甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)试剂盒，四川迈克生物科技股份有限公司；高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)试剂盒，宁波美康生物科技股份有限公司；Hcy试剂盒，金华市强盛生物科技有限公司；日立7180型全自动生化分析仪，日本株式会社日立高新技术。

2 方法

2.1 分组及造模

大鼠适应性喂养3 d后，按体质量随机分为空白组、2%、1.5%、1%蛋氨酸灌胃组和2%、1.5%、1%蛋氨酸饮水组各3只。第4天开始造模，各组大鼠按照10 ml/kg灌胃给予相应药物，每日2次，空白组和饮水组均给予等体积的纯净饮用水，连续灌胃6 周。灌胃组于第4周起按20 ml/kg灌胃给药，饮水组第5周停止添加蛋氨酸观察1周。根据前6周筛选结果，将20只大鼠根据体质量和血清Hcy含量随机分成对照组和模型组进行重复性和稳定性验证，每组10只，灌胃4周，给药体积20 ml/kg。

2.2 标本制备

造模前测定正常饮水量、饲料消耗量和血清Hcy含量1次，造模后记录体质量、饲料日消耗量和饮水量，每周尾静脉取血1次检测血清Hcy及血脂4项含量。重复性实验方法同上，但只检测血清Hcy含量，2周1次。

2.3 统计学方法

实验数据符合正态分布采用单因素方差分析，不符合正态分布采用非参数2个独立样本t检验进行分析。

3 结果

3.1 各组大鼠体质量、日饲料消耗量、日饮水量变化

图1显示，第3周以后1%灌胃组体质量较空白组高，1.5%和2%饮水组大鼠在第2周以后均低于空白组，且2%饮水组在第4周显著低于空白组(P<0.05)。第5周停止添加蛋氨酸后，饮水组体质量相对增加量大于空白组和灌胃组。

图1 各组动物体质量变化比较 (单位：g)注：与空白对照组比较:*P<0.05，**P<0.01

表1显示，各组大鼠的日饲料消耗量均逐渐下降，各灌胃组和1%饮水组第4、5、6 周日饲料消耗量都高于空白组，变化趋势与体质量基本一致。表2显示，各组大鼠的日饮水量均逐步下降，第3周后饮水组波动幅度较大。

表1 各组大鼠日饲料消耗量的变化比较 (g/100 g体质量)

表2 各组大鼠日饮水量的变化比较(ml/100 g体质量)

3.2 各组大鼠血清TC、TG、HDL和LDL含量变化

图2显示，与空白组比较，1%灌胃组在第3周、1%饮水组在第3、4周、1.5%饮水组在第5周和2%饮水组TC在第6周比较差异有统计学意义(P<0.05)。图3显示，仅2%饮水组大鼠血清TG明显升高(P<0.05)，其余各组无明显变化(P>0.05)。

图2 血清TC含量变化(mmol/L)注：与空白对照组比较:*P<0.05，**P<0.01

图3 血清TG含量变化(mmol/L)

图4显示，与空白组比较，灌胃组与饮水组大鼠血清HDL含量比较差异无统计学意义 (P>0.05)但有增加趋势。图5显示，与空白组比较，除2%饮水组外(P<0.05)其余各组大鼠血清中LDL含量比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3.3 各组大鼠蛋氨酸日摄入量和血清Hcy含量变化

图4 血清LDL含量变化(mmol/L)注：与空白对照组比较:*P<0.05，**P<0.01

图5 血清LDL含量变化(mmol/L)

表3显示，第1～4周等浓度灌胃组和饮水组蛋氨酸日摄入量相差2～4倍，灌胃组调整给药体积后，从第5周可以看出两者蛋氨酸日摄入量相差不大。

表3 各组大鼠蛋氨酸日摄入量(g/3只)

图6 血清Hcy含量变化(μmol/L)注：与空白对照组比较:*P<0.05，**P<0.01

图6显示，与空白组比较，灌胃组在第6周其血清Hcy比较差异有统计学意义(P<0.05)，而1.5%灌胃组在第5周比较差异有统计学意义(P<0.01)；而饮水组造模1周后血清Hcy含量起伏不定，各组内个体差异极大。值得注意的是，1%、1.5%饮水组血清Hcy含量在第5周前均曾恢复正常，停药1周饮水组血清Hcy水平全部恢复至正常。

图7 大鼠血清Hcy的影响(重复性实验)注：与空白对照组比较:*P<0.05，**P<0.01

图7显示，在重复性实验中与对照组比较，第2周起模型组大鼠血清Hcy差异有统计学意义(P<0.01)，表明该法稳定可靠、重现性好且个体差异小。

4 讨论

本研究最初造模4周后，灌胃组大鼠血清Hcy含量未达到HHcy造模要求。由于蛋氨酸日摄入量相差2～4倍,因此后续实验中灌胃组给药体积增大1倍。灌胃组血清Hcy水平在2周内即达到Hhcy造模，要求且1.5%灌胃组Hcy含量升高最明显。进一步重复性实验表明，1.5%蛋氨酸灌胃法制备HHcy模型重现性好且较稳定。相对而言，虽然饮水组血清Hcy含量较高，但个体差异极大且易恢复正常，说明饮水添加法制备HHcy模型不稳定易反弹。

同时，2%蛋氨酸灌胃和1.5%、2%饮水可抑制动物生长即有毒性作用，而1.5%蛋氨酸灌胃和1%饮水添加对动物体质量影响不大即为适合的造模浓度。但饮水组的日饲料消耗量和饮水量低于灌胃组，且动物个体间蛋氨酸摄入量不均一，这可能是引起血清Hcy水平反弹的重要原因，也是导致模型动物个体差异较大的关键因素。再者,本研究中仅2%饮水组在第6周对血清TC、TG、LDL-C含量有较大影响，但这个浓度的蛋氨酸具有明显的毒性作用；而灌胃法对大鼠血脂水平无明显影响,但对其有增长趋势，这可能与造模时间较短有关。此外本研究发现，停止添加蛋氨酸1周后，饮水组血清Hcy水平均恢复至正常，这提示蛋氨酸制备HHcy大鼠模型只适用于预防性给药研究。综上,本研究表明 1.5%蛋氨酸灌胃是制备HHcy大鼠模型较理想的方式，具有操作简单、重现性好、模型稳定不反弹、个体差异小、不影响动物生长和血脂水平等优点，值得推广使用。

[1] 那开宪.高同型半胱氨酸血症诊治中的一些误区[J].中国临床医生杂志,2017,45(2):18-22.

[2] 刘新芳,姜雅秋.辛伐他汀对高同型半胱氨酸血症模型大鼠急性心肌梗死再灌注后血清ET-1、AngⅠ、AngⅡ、CRP、MPO水平的影响[J].中国老年学杂志,2014,34(3):734-735.

[3] 吴乐,刘子建,黎红华,等.普罗布考对高同型半胱氨酸血症兔主动脉粥样硬化及5-脂氧酶表达的影响[J].中国组织化学与细胞化学杂志,2015,24(1):23-26.