白念珠菌烯醇化酶的研究进展*

王廷廷，贺政新，王缚鲲(1.河北医科大学研究生院，石家庄 050000；.解放军白求恩国际和平医院检验科，石家庄 050000)

·综述·

白念珠菌烯醇化酶的研究进展*

王廷廷1,2，贺政新2，王缚鲲2
(1.河北医科大学研究生院，石家庄 050000；2.解放军白求恩国际和平医院检验科，石家庄 050000)

念珠菌是与人类共生的条件致病菌，能导致系统性念珠菌感染和深部念珠菌侵袭。烯醇化酶是白念珠菌生长过程中的一种关键的糖酵解代谢酶，同时也是侵袭感染过程中重要的免疫优势抗原，在白念珠菌致病、血清学诊断和宿主抵抗白念珠菌感染过程中发挥重要作用。对烯醇化酶的深入研究将为制备蛋白质疫苗以及正确选择临床抗真菌药物提供理论依据。该文就白念珠菌烯醇化酶的基因结构、致病机制、诊断价值和疫苗研发方面作一综述。

烯醇化酶；基因结构；致病机制；血清学诊断；疫苗

随着广谱抗生素的广泛使用以及侵入性手术的广泛开展，侵袭性念珠菌病(invasive candidiasis，IC)的发病率和死亡率逐年增高。白念珠菌已成为美国医院血流感染第4常见病原菌，致死率高达50%[1]。由于该病的临床症状缺乏特异性，实验室诊断金标准方法血培养存在检测时间长、阳性率低等缺点，寻找新的诊断标志物迫在眉睫。烯醇化酶(enolase，Eno)又称2-磷酸-D-甘油盐水解酶，是主要存在于白念珠菌胞壁与胞浆中的一种糖酵解代谢关键酶，在念珠菌感染期间被大量分泌。体外实验发现，Eno分别占酵母相和菌丝相总蛋白质的0.7%和2%[2]，是念珠菌中含量丰富的蛋白质之一。通过研磨、硫酸铵沉淀、色谱等步骤将Eno进行分离和纯化，证实该酶是由440个氨基酸组成，相对分子质量约为46 000～48 000；Eno在pH 6.8时活性最强，Mg2+为该酶的最有效活化剂[3]。蛋白质组学研究显示，Eno是念珠菌感染过程中的主要免疫优势抗原，其抗原或者抗体的检测已成为IC实验室诊断研究的热点。本文就Eno的基因及表达、参与念珠菌致病性、对IC的诊断价值、疫苗的开发与应用4个方面进行阐述。

1 烯醇化酶基因及表达

Eno基因是一种共享基因，存在于细菌、酵母、果蝇、两栖动物、鸟类和人类等物种体内，含量丰富且具有高度保守性[4]。白念珠菌Eno有1或2个编码基因编码，通过DNA限制性酶切技术结合基因组southern印迹分析显示Eno编码基因ClaI和MnlI位点在其3′端区存在差异[5]。Sundstrom[2]等从白念珠菌cDNA文库中对Eno基因进行分离并测序，证实该基因是一个含有1 320 bp连续开放阅读框的片段，编码的440个氨基酸蛋白与酿酒酵母细胞编码的Eno1和Eno2分别有78%和76%的同源性，与人类细胞的α、β烯醇化酶的相似性分别为65.1%和65.5%。与酿酒酵母细胞烯醇化酶A的晶体结构相比较，发现白念珠菌Eno在α螺旋、β折叠和β转角区域中保守性较强，但白念珠菌Eno残基在134至138间以β结构代替α螺旋[2]，这是造成二者Eno三级结构差异较大的原因。

白念珠菌Eno mRNA水平与念珠菌的酵母相或者菌丝相无关，而与生长周期有关：mRNA含量在念珠菌对数生长的中间阶段最高，在稳定期水平较低[5]。当白念珠菌在几种不同的营养条件下培养时发现，细胞无论是在葡萄糖培养基上还是在不可发酵的碳源培养基上都能生长。但是在葡萄糖培养基上生长速度显著快于在乙醇培养基上的生长速度，其Eno mRNA水平也出现相应的变化，可见在不同营养条件下白念珠菌细胞生长代谢状态可发生变化[6]。

2 烯醇化酶与疾病发生

白念珠菌Eno的释放与念珠菌的侵袭感染有关，寄生在浅表部位的白念珠菌一般不会释放该酶[2]。在IC患者血清中检出Eno抗原及抗Eno抗体水平明显高于体检健康者[7]。研究认为Eno是IC的免疫优势抗原，但是其在致病过程中发挥的作用还不明确。研究发现白念珠菌与宿主细胞或组织粘附结合的能力对于它的侵袭与增殖非常重要，一些能与念珠菌结合的宿主细胞表面受体已被发现，主要是胞外基质组分，如纤层蛋白、纤维蛋白原、纤维蛋白[8]。其侵袭过程主要是：白念珠菌细胞通过未知机制将Eno输送至细胞表面，存在于胞体表面的Eno在侵染宿主时，可发挥纤溶酶原受体的作用，通过与纤溶酶原结合激活其转化为有活性的纤溶酶，发挥蛋白质水解酶的作用，降解细胞外基质。这一过程利用宿主自身的纤溶系统破坏组织屏障，促进病原体在组织中的侵袭与扩散[8]。以下证据支持白念珠菌与人类纤溶酶原/纤溶酶结合而导致侵袭的发生：各种念珠菌菌株都可以与纤溶酶原或活化形式的纤溶酶结合；重组Eno可以以剂量依赖方式与125I标记的纤溶酶结合而保留在镍螯合亲和柱基质中；和许多纤溶酶原受体一样，Eno的结合也是赖氨酸依赖性；与Eno结合的纤溶酶原能增加其对链激酶的亲和力。为了阐明Eno-纤溶酶原相互作用的生物学意义，有研究通过体外实验证明了纤溶酶原能够结合白念珠菌细胞，并诱导纤维蛋白溶解，具有增强穿过血脑屏障的作用[9]。Eno作为一种胞壁蛋白，还能与一些血浆凝血因子高分子量激肽原(HK)、激肽释放酶原(PPK)和FXⅡ因子相结合，促使宿主细胞产生大量与血管活性肽相关的促进炎症反应的激肽分子，触发细胞表面激肽形成级联放大反应[10]。此外，Silva等[11]发现将重组Eno预先与肠上皮黏膜细胞粘附后，可抑制其与白念珠菌胞体的结合，这提示在肠上皮细胞或黏液中可能存在一种能与Eno结合的受体，调控白念珠菌在肠黏膜上皮的粘附与增殖。菌体与宿主蛋白之间的相互作用促进了念珠菌的粘附，并使念珠菌利用宿主自身的纤溶系统降解细胞外基质和纤维蛋白,以帮助菌体穿透基底膜，突破内皮细胞，破坏细胞的防御屏障，进入血液循环或者深部组织、器官，为侵袭宿主导致IC奠定基础。

Eno不仅与免疫抑制患者IC的发生有关，同时也是正常人群中一种重要的过敏原。Kortekangas-Savolainen等用免疫印迹试验来检测酿酒酵母的过敏原，结果显示酿酒细胞提取物皮试试验阳性患者的血清能与酿酒酵母的22种抗原反应，其中最主要的是48 000条带，其位置与白念珠菌的Eno条带基本一致，说明Eno可能是主要的过敏原[12]。此外，有研究证实Eno表面IgE结合位点可能定位于aa361-aa390之间[13]。白念珠菌的Eno与酿酒酵母、黄曲霉等的Eno有共同的抗原表位，这种引起过敏反应的Eno主要在真菌表面进行呈递，可作为变应原的主要免疫识别位点[14]，引起机体产生持续的过敏反应和高滴度的IgE抗体，导致原有过敏症状患者过敏反应加重和过敏性鼻炎、哮喘等症状。

3 烯醇化酶血清学诊断价值

Eno不仅参与病原菌与宿主的相互作用，还是诊断学研究的靶分子。以念珠菌特异性抗原或抗体为检测对象的血清学方法，凭借其敏感、简便、易于开展的优势，成为实验室研究快速诊断IC的热点。临床上用ELISA对已经确诊的深部念珠菌侵袭性感染和念珠菌血症患者进行血清学Eno抗原的连续监测，敏感性分别为85%和64%[15]。胡毓安等[16]首次评价了ELISA定量检测Eno在IC中的诊断价值，采用的双抗体夹心法可以识别白念珠菌增殖过程中产生的Eno抗原，具有较高的特异性。

考虑到念珠菌抗原在宿主体内可能被快速清除，故研究抗Eno抗体在检测中的价值更为广泛。念珠菌侵袭感染期间，高免疫原性Eno蛋白质的释放刺激宿主产生细胞免疫和体液免疫应答，促使大量淋巴细胞活化以及产生大量针对Eno的IgG抗体。本实验室在系统性念珠菌感染(systemic candidiasis，SC)小鼠血清中连续检测到高滴度的抗Eno抗体[17]。Pitach等[18]应用免疫蛋白质组学分析SC患者血清与15种白念珠菌原生质体蛋白质间的相互作用，显示抗Eno抗体可作为SC的重要诊断标志物。Mitsutake等[19]用免疫印迹方法对27例SC患者进行抗Eno IgG抗体检测，发现在感染早期检出率为62.9%，随着病情发展检测阳性率也增加到92.5%。胶乳凝集实验、ELISA、免疫固定电泳等方法越来越多地被用于抗Eno抗体的检测[20-21]。本实验室以重组Eno作为检测抗原，开发的胶体金免疫层析试纸，能够在15 min内完成抗Eno抗体检测[22]。Li等[21]用Eno作为检测抗原，发现用ELISA方法可以区分真菌侵袭性感染和定植，这与以往Van Deventer等的研究结果一致，而免疫对流电泳不能将两者进行区分[23]。1，3-β-D-葡聚糖检测，又称为G试验，是目前能够辅助临床诊断IC的方法之一。有研究将抗Eno抗体和G试验检测结果相比较，发现抗Eno抗体检测的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值(46.7%、86.7%、21.2%、95.5%)均优于 G 试验(33.3%、74.9%、9.3%、93.6%)，两者联合检测可提高检测的敏感性[24]。Pitarch等[25]发现非中性粒细胞减少患者的IC发病率和死亡率逐年增高，用蛋白质组学分析显示，血清学22种IgG抗体谱可将IC和非IC组进行区分，该类标志物中具有代表性的抗HSP90与抗Eno抗体联合检测则更能准确地诊断IC。

抗Eno抗体滴度在疾病的不同发展阶段有相应的改变。血清学抗体监测不仅可以帮助临床医生诊断念珠菌感染，还可以监测病程的发展以及帮助临床医生评价临床抗真菌治疗效果。在念珠菌侵袭感染的早期，抗Eno抗体即可增高并可维持一段时间；而当临床治愈念珠菌感染时，IgG抗体逐渐下降并消失，IgA、IgM抗体恢复到正常范围，预示抗Eno抗体的滴度变化与SC的恢复有关，并有可能作为SC患者的预后标志物[26-27]。

4 烯醇化酶疫苗开发与应用

疫苗具有毒副作用小，靶向选择性等优点，将成为预防和治疗念珠菌感染的有效措施。已有多种疫苗用来预防和治疗IC，如灭活菌苗、蛋白质组分疫苗、胞壁成分疫苗等，其针对白念珠菌的免疫原性和功效在实验动物模型中已被研究，甚至部分已经在临床试验中验证了其疗效及安全性[28]。

当将重组Eno免疫小鼠，再给小鼠注射白念珠菌细胞时，发现在肾脏、脑组织、肺、脾等组织结构中的真菌量大大减少，其血清抗Eno IgG1和IgG2a抗体滴度高达51 200，减少了炎症细胞的产生，IL-12和IL-8水平增加；TH2型细胞因子IL-10水平较对照组水平大大增高，可见重组Eno的接种可保护小鼠免于念珠菌的侵袭[29]，这可能与TH1或TH2细胞介导的免疫应答保护作用相关。目前，已有一种组合β-甘露聚糖和念珠菌蛋白肽表位的合成糖肽疫苗用于对抗小鼠播散性念珠菌的侵袭[30]，但是这种基于化学合成糖肽疫苗的方法比较繁琐、复杂，很难得到广泛开发与使用。Shibasaki等开发了一种新的抗念珠菌感染口服疫苗，减少了制备注射型疫苗的繁琐步骤，并用小鼠模型研究模拟口服Eno疫苗的临床功效，结果发现口服疫苗的小鼠产生大量抗Eno IgG抗体，存活率大大增加；同时，乳酸杆菌可作为一种有效的佐剂，可以协助产生高滴度抗体[31-32]，且该方法加工过程较少。目前，Eno的免疫调节及作为疫苗候选抗原分子的免疫保护作用并不清晰，还需要进一步研究。

综上所述，Eno是白念珠菌生长过程中的一种关键代谢酶，Eno基因及表达的研究对于了解白念珠菌分泌Eno的机制有重要意义。尽管目前对Eno的研究较多，但是其在IC的致病过程中发挥的作用及具体机制还需要人们更深步的研究，这一领域的研究进展将为制备Eno蛋白疫苗以及正确选择临床抗菌药物提供理论依据。迄今为止，尽管还没有一种满意的快速诊断IC的实验室诊断方法，但是抗Eno抗体的检测，特别是ELISA方法，有望进一步得到规范，结合现有的真菌诊断技术方法，成为临床辅助诊断IC的依据。

[1]Andes DR, Safdar N, Baddley JW,etal. Impact of treatment strategy on outcomes in patients with candidemia and other forms of invasive candidiasis: a patient-level quantitative review of randomized trials[J]. Clin Infect Dis,2012, 54(8):1110-1122.

[2]Sundstrom P, Aliaga GR. Molecular cloning of cDNA and analysis of protein secondary structure ofCandidaalbicansenolase, an abundant, immunodominant glycolytic enzyme[J]. J Bacteriol,1992, 174(21):6789-6799.

[3]Kustrzeba-Wojcicka I and Golczak M. Enolase fromCandidaalbicans--purification and characterization[J]. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol,2000, 126(1):109-120.

[4]Van der Straeten D, Rodrigues-Pousada RA, Goodman HM,etal. Plant enolase: gene structure, expression, and evolution[J]. Plant Cell,1991, 3(7):719-735.

[5]Postlethwait P,Sundstrom P. Genetic organization and mRNA expression of enolase genes ofCandidaalbicans[J]. J Bacteriol,1995, 177(7):1772-1779.

[6]Mason AB, Buckley HR, Gorman JA. Molecular cloning and characterization of theCandidaalbicansenolase gene[J]. J Bacteriol,1993, 175(9):2632-2639.

[7]Clancy CJ, Nguyen ML, Cheng S,etal. Immunoglobulin G responses to a panel ofCandidaalbicansantigens as accurate and early markers for the presence of systemic candidiasis[J]. J Clin Microbiol,2008, 46(5):1647-1654.

[8]Ghosh AK, Jacobs-Lorena M. Surface-expressed enolases ofPlasmodiumand other pathogens[J]. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz,2011, 106(Suppl 1):85-90.

[9]Jong AY, Chen SH, Stins MF,etal. Binding ofCandidaalbicansenolase to plasmin(ogen) results in enhanced invasion of human brain microvascular endothelial cells[J]. J Med Microbiol,2003, 52(Pt 8):615-622.

[10]Seweryn K, Karkowska-Kuleta J, Wolak N,etal. Kinetic and thermodynamic characterization of the interactions between the components of human plasma kinin-forming system and isolated and purified cell wall proteins ofCandidaalbicans[J]. Acta Biochim Pol,2015, 62(4):825-835.

[11]Silva RC, Padovan AC, Pimenta DC,etal. Extracellular enolase ofCandidaalbicansis involved in colonization of mammalian intestinal epithelium[J]. Front Cell Infect Microbiol,2014, 4:66.

[12]Kortekangas-Savolainen O, Kalimo K, Lammintausta K,etal. IgE-binding components of bake′s yeast(Saccharomyces cerevisiae) recognized by immunoblotting analysis. Simultaneous IgE binding to mannan and 46-48 kD allergens ofSaccharomycescerevisiaeandCandidaalbicans[J]. Clin Exp Allergy,1993, 23(3):179-184.

[13]Ito K, Ishiguro A, Kanbe T,etal. Characterization of IgE-binding epitopes onCandidaalbicansenolase[J]. Clin Exp Allergy,1995, 25(6):529-535.

[14]Funk J, Schaarschmidt B, Slesiona S,etal. The glycolytic enzyme enolase represents a plasminogen-binding protein on the surface of a wide variety of medically important fungal species[J]. Int J Med Microbiol,2016, 306(1):59-68.

[15]Walsh TJ, Hathorn JW, Sobel JD,etal. Detection of circulating candida enolase by immunoassay in patients with cancer and invasive candidiasis[J]. N Engl J Med,1991, 324(15):1026-1031.

[16]胡毓安, 李芳秋, 马春芳, 等. 白念珠菌烯醇化酶双抗体夹心ELISA检测方法的建立[J]. 临床检验杂志,2013, 31(8):565-568.

[17]He ZX, Chen J, Li W,etal. Serological response and diagnostic value of recombinantcandidacell wall protein enolase, phosphoglycerate kinase, and β-glucosidase[J]. Front Microbiol,2015, 6:920.

[18]Pitarch A, Jimenez A, Nombela C,etal. Serological proteome analysis to identify systemic candidiasis patients in the intensive care unit: Analytical, diagnostic and prognostic validation of anti-Candidaenolase antibodies on quantitative clinical platforms[J]. Proteomics Clin Appl,2008, 2(4):596-618.

[19]Mitsutake K, Kohno S, Miyazaki T,etal. Detection ofCandidaenolase antibody in patients with candidiasis[J]. J Clin Lab Anal,1994, 8(4):207-210.

[20]Lain A, Moragues MD, Ruiz JC,etal. Evaluation of a novel enzyme-linked immunosorbent assay to detect immunoglobulin G antibody to enolase for serodiagnosis of invasive candidiasis[J]. Clin Vaccine Immunol,2007, 14(3):318-319.

[21]Li FQ, Ma CF, Shi LN,etal. Diagnostic value of immunoglobulin G antibodies againstCandidaenolase and fructose-bisphosphate aldolase for candidemia[J]. BMC Infect Dis,2013, 13:253.

[22]He ZX, Shi LC, Ran XY,etal. Development of a lateral flow immunoassay for the rapid diagnosis of invasive candidiasis[J]. Front Microbiol,2016, 7:1451.

[23]van Deventer AJ, van Vliet HJ, Hop WC,etal. Diagnostic value of anti-Candidaenolase antibodies[J]. J Clin Microbiol,1994, 32(1):17-23.

[24]廖红, 李芳秋, 张国勇, 等. 抗烯醇化酶抗体与(1-3)-β-D-葡聚糖检测诊断侵袭性念珠菌病的临床比较[J]. 中国真菌学杂志,2014, 9(5):271-274.

[25]Pitarch A, Nombela C, Gil C. Serum antibody signature directed againstCandidaalbicansHsp90 and enolase detects invasive candidiasis in non-neutropenic patients[J]. J Proteome Res,2014, 13(11):5165-5184.

[26]Pitarch A, Diez-Orejas R, Molero G,etal. Analysis of the serologic response to systemicCandidaalbicansinfection in a murine model[J]. Proteomics,2001, 1(4):550-559.

[27]Pitarch A, Abian J, Carrascal M,etal. Proteomics-based identification of novelCandidaalbicansantigens for diagnosis of systemic candidiasis in patients with underlying hematological malignancies[J]. Proteomics, 2004, 4(10):3084-3106.

[28]Wang X, Sui X, Yan L,etal. Vaccines in the treatment of invasive candidiasis[J]. Virulence,2015, 6(4):309-315.

[29]Li W, Hu X, Zhang X,etal. Immunisation with the glycolytic enzyme enolase confers effective protection againstCandidaalbicansinfection in mice[J]. Vaccine,2011, 29(33):5526-5533.

[30]Xin H, Dziadek S, Bundle DR,etal. Synthetic glycopeptide vaccines combining beta-mannan and peptide epitopes induce protection against candidiasis[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2008, 105(36):13526-13531.

[31]Shibasaki S, Karasaki M, Tafuku S,etal. Oral immunization against candidiasis using lactobacillus casei displaying enolase 1 fromCandidaalbicans[J]. Sci Pharm,2014, 82(3):697-708.

[32]Shibasaki S, Ueda M. Oral vaccine development by molecular display methods using microbial cells[J]. Methods Mol Biol,2016, 1404:497-509.

(本文编辑：周万青，刘群)

河北省医学科学研究重点课题计划(ZD20140031，20150317)；解放军白求国际和平医院计划课题(201430，201514)。

王廷廷，1990年生，女，硕士研究生，从事分子检验诊断研究。

王缚鲲，主任医师，博士，E-mail:wangfk8@sina.com。

10.13602/j.cnki.jcls.2017.04.15

R446.5

A

2017-01-22)